文献阅读-花粉特异的PCP-B小肽竞争结合柱头受体促进花粉萌发

大家好，本次阅读的文章是今日发表在《science》上《Pollen PCP-B peptides unlock a stigma 1 peptide–receptor kinase gated mechanism for pollination》的一文，通讯作者是华东师范大学的李超。

双受精的起始依赖于花粉与柱头的相互作用，但是目前这一机制尚未得到解决。

首先，作者发现在成熟且未受精的柱头上会存在ROS积累，且在花粉与柱头的粘附一分钟后ROS信号就开始减弱，且在10min内能够观察到明显的ROS降低，但是如果利用一个水合出现问题的突变体PCP-B(pcp60bγ  pcp-bβ/γ)授粉，对于柱头ROS的抑制能力下降，暗示在花粉的正常水合过程柱头中ROS水平下降非常重要。随后作者利用昆虫细胞表达以及化学合成了PCP-Bγ，发现该小肽可能形成四对二硫键，如果将合成的小肽施加到柱头上，ROS明显下降，如果将关键的cys突变体的，则ROS不能正常下降。那么ROS到底在这个过程中发挥什么作用呢？如果在正常萌发的前十分钟内，加入ROS的抑制剂或是清除剂，花粉的水合速度在前十分钟内明显加快。暗示PCP-Bs诱导的ROS降低可能对于花粉水合的速度非常重要。

PCP-B peptides in pollen trigger reductions in stigmatic ROS levels

随后作者想要探索识别PCP-B的小肽到底是什么？通过多个数据库发现ANJ以及同家族的FER均在柱头存在高表达，GUS的数据进一步支持该结论。随后分别拿到单突和双突，发现均存在水合速度加快的表型，且可以回补。有趣的是，在anj fer-4 双突中，ROS水平维持在较低的水平，且双突做雌方时，无论是WT或是pcp-b 突变体做雄方水合速度均加快并且因此花粉在刚开始长时变长。随后通过生化实验以及luciferase验证了FER和ANJ的相互作用，而未成熟PCP可以与FER ANJ结合。说明PCP可以与FER以及ANJ一起调控ROS的清除。

ANJ and FER are crucial for pollen hydration and PCP-Bγ-induced304 decreases in ROS levels in stigmatic papilla cells

RALFs长期以来被认为是crRLK1L家族的配体，通过筛选发现RALF23/33在柱头表达，通过生化实验验证了RALF33与FER和ANJ的互作（且证明关键位点），遗传学上ralf33的突变体表型类似于anj fer双突，更快的水合和更长的花粉管以及较低的ROS，且外源处理RALF33能够使得ROS水平增加，而anj fer中不敏感。说明RALF33-FER/ANJ位于同一条信号通路上（表型一致）。

在先前其他表型的研究中共受体LLG以及RAC/ROP所调控的 NADPH oxidases对于ROS的产生非常重要，通过筛选在柱头表达这些家族的成员，拿到llg1, rop2 和 rbohd 的突变体，均出现ROS积累变少的表型，类似于 fer，使用ROP2p::rop2CA的载体（持续激活ROS）能够部分回补fer-4的表型，且在llg1,  rbohd 外源使用RALF33处理，ROS增强的表型不敏感。因此构建起RALF33-ANJ/FER/LLG1-ROP2-RBOHD调控水合速度放慢的信号通路

RALF33 stimulate the ANJ–FER receptor complex to induce ROS production through the RAC/ROP–NADPH oxidase pathway

那么PCP是如何与RALF33协同调控花粉萌发过程的呢？考虑到两者表型相反，很可能是竞争关系。在体外施加PCP-Bγ能够竞争性去除RALF33施加导致的ROS增加的表型，同样的在luciferase以及pull down中均观察到竞争性结合的结果，而Microscale thermophoresis和FITC则进一步通过测定亲和常数来进一步证明竞争关系。

PCP-Bs compete with RALF23/33 for interaction with the ANJ–FER  receptor complex

model

因此本文发现了一条PCP-Bγ竞争性与RALF33结合从而导致ANJ/FER/LLG1-ROP2-RBOHD信号失活使得ROS积累下降，促进水合从而促进萌发的过程。