转载来自：刘小泽 链接：https://www.jianshu.com/p/e659a2f164f7
刘小泽写于19.7.5-第二单元第六讲：聚类算法之PCA与tSNE
笔记目的：根据生信技能树的单细胞转录组课程探索smart-seq2技术相关的分析技术
课程链接在：https://www.bilibili.com/video/BV1dt411Y7nn?p=9
还是之前文章附件的图片，其中b图是选取两个主成分做的PCA图，c图是tSNE图：
image
几个常用函数的转置t(transpose)，傻傻分不清？： 计算距离介绍过
dist()函数，它是按行为操作对象，而聚类是要对样本聚类，因此要先将我们平时见到的表达矩阵(行为基因，列为样本)转置；同样PCA也是对行/样本进行操作，也是需要先转置；另外归一化的scale()函数虽然是对列进行操作，但它的对象是基因，因此也需要转置
关于PCA的学习，之前写过：
- StatQuest-PCA学习：https://www.jianshu.com/p/b83ac8f7f5a7
- StatQuest--在R中拆解PCA：https://www.jianshu.com/p/8a74508c3737
先构建一个非常随机的测试数据
# 设置随机种子，可以重复别人使用的随机数
set.seed(123456789)
library(pheatmap)
library(Rtsne)
library(ggfortify)
library(mvtnorm)
# 设置两个正态分布的随机矩阵(500*20)
ng=500
nc=20
a1=rnorm(ng*nc);dim(a1)=c(ng,nc)
a2=rnorm(ng*nc);dim(a2)=c(ng,nc)
a3=cbind(a1,a2)
> dim(a3)
[1] 500 40
# 添加列名
colnames(a3)=c(paste0('cell_01_',1:nc),
paste0('cell_02_',1:nc))
# 添加行名
rownames(a3)=paste('gene_',1:ng,sep = '')
# 先做个热图
pheatmap(a3)
image
没有体现任何的基因差异或者样本聚类（热图中的聚类是自然层次聚类），可以看到样本名都是无规律的交叉显示
如果做PCA呢？
# 先转置一下，让行为样本
> a3=t(a3);dim(a3)
[1] 40 500
# prcomp()主成分分析
pca_dat <- prcomp(a3, scale. = TRUE)
p=autoplot(pca_dat) + theme_classic() + ggtitle('PCA plot')
print(p)
image
可以看到每组的20个细胞都分不开，但每组具体有哪些样本还是看不出来，因此这里为每组加上颜色来表示
# 先在原来数据的基础上添加样本分组信息(别忘了a3是一个矩阵，先转换成数据框)
df=cbind(as.data.frame(a3),group=c(rep('b1',20),rep('b2',20)))
autoplot(prcomp( df[,1:(ncol(df)-1)] ), data=df,colour = 'group')+theme_bw()
image
另外看下tsne
利用了一个核心函数Rtsne()
set.seed(42)
tsne_out <- Rtsne(a3,pca=FALSE,perplexity=10,theta=0.0)
# 结果得到一个列表
> str(tsne_out)
List of 14
$ N : int 40
$ Y : num [1:40, 1:2] -36.7 -28 -168 -33.4 22.4 ...
$ costs : num [1:40] 0.00348 -0.00252 0.01496 0.01646 0.00951 ...
# 其中在Y中存储了画图坐标
> head(tsne_out$Y,3)
[,1] [,2]
[1,] -36.72621 -78.03709
[2,] -28.00151 33.30229
[3,] -167.98560 -80.26850
tsnes=tsne_out$Y
colnames(tsnes) <- c("tSNE1", "tSNE2") #为坐标添加列名
# 基础作图代码
ggplot(tsnes, aes(x = tSNE1, y = tSNE2))+ geom_point()
# 在此基础上添加颜色分组信息，首先还是将tsnes这个矩阵变成数据框，然后增加一列group信息，最后映射在geom_point中
tsnes=as.data.frame(tsnes)
group=c(rep('b1',20),rep('b2',20))
tsnes$group=group
ggplot(tsnes, aes(x = tSNE1, y = tSNE2))+ geom_point(aes(col=group))
image
再构建一个有些规律的测试数据
ng=500
nc=20
a1=rnorm(ng*nc);dim(a1)=c(ng,nc)
# 和之前的区别就在a2这里，都加了3
a2=rnorm(ng*nc)+3;dim(a2)=c(ng,nc)
a3=cbind(a1,a2)
colnames(a3)=c(paste0('cell_01_',1:nc),paste0('cell_02_',1:nc))
rownames(a3)=paste('gene_',1:ng,sep = '')
pheatmap(a3)
image
热图已经能看出来差异了，再看看PCA
a3=t(a3);dim(a3)
df=cbind(as.data.frame(a3),group=c(rep('b1',20),rep('b2',20)))
autoplot(prcomp( df[,1:(ncol(df)-1)] ), data=df,colour = 'group')+theme_bw()
image
tsne也是如此
set.seed(42)
tsne_out <- Rtsne(a3,pca=FALSE,perplexity=10,theta=0.0)
tsnes=tsne_out$Y
colnames(tsnes) <- c("tSNE1", "tSNE2")
tsnes=as.data.frame(tsnes)
group=c(rep('b1',20),rep('b2',20))
tsnes$group=group
ggplot(tsnes, aes(x = tSNE1, y = tSNE2))+ geom_point(aes(col=group))
image
真实数据演练
载入RPKM数据
rm(list = ls())
options(stringsAsFactors = F)
load(file = '../input_rpkm.Rdata')
# 表达量信息
> dat[1:2,1:3]
SS2_15_0048_A3 SS2_15_0048_A6 SS2_15_0048_A5
0610007P14Rik 0 0 74.95064
0610009B22Rik 0 0 0.00000
# 样本属性
> head(metadata,3)
g plate n_g all
SS2_15_0048_A3 1 0048 3065 all
SS2_15_0048_A6 2 0048 3036 all
SS2_15_0048_A5 1 0048 3742 all
#所有数据的聚类分组信息
group_list=metadata$g
#批次信息
plate=metadata$plate
> table(plate)
plate
0048 0049
384 384
对数据进行PCA
# 操作前先备份
dat_back=dat
# 先对表达矩阵进行转置，然后转换成数据框，就可以添加批次信息了
dat=dat_back
dat=t(dat)
dat=as.data.frame(dat)
dat=cbind(dat,plate )
> dim(dat_back)
[1] 12689 768
> dim(dat)
[1] 768 12690
library("FactoMineR")
library("factoextra")
dat.pca <- PCA(dat[,-ncol(dat)], graph = FALSE)
fviz_pca_ind(dat.pca, # repel =T,
geom.ind = "point", # 只显示点，不显示文字
col.ind = dat$plate, # 按分组上色
#palette = c("#00AFBB", "#E7B800"),
addEllipses = TRUE, # 添加晕环
legend.title = "Groups"
image
可以看到两个批次之间分不开，说明没有批次效应
对数据进行tsne
library(Rtsne)
load(file = '../input_rpkm.Rdata')
dat[1:4,1:4]
dat_matrix <- t(dat)
dat_matrix =log2(dat_matrix+0.01)
# Set a seed if you want reproducible results
set.seed(42)
tsne_out <- Rtsne(dat_matrix,pca=FALSE,perplexity=30,theta=0.0) # Run TSNE
# Show the objects in the 2D tsne representation
plot(tsne_out$Y,col= plate) # asp=1
# https://distill.pub/nc16/misread-tsne/
image.png
美化图片：
>library(ggpubr)
# Add marginal rug
>head(tsne_out$Y)
## [,1] [,2]
[1,] -2.2186865 11.1212936
[2,] -6.2008007 12.9061310
[3,] -0.8396856 0.5376436
[4,] -2.8298850 -17.4342206
[5,] 9.6369513 0.6651455
[6,] -4.3156922 -21.4274021
>df=as.data.frame(tsne_out$Y)
>colnames(df)=c("X",'Y')
>df$plate= plate
##df$g 分群信息是基于之前hist
>df$g=metadata$g
>head(df)
X Y plate g
1 -2.2186865 11.1212936 0048 1
2 -6.2008007 12.9061310 0048 2
3 -0.8396856 0.5376436 0048 1
4 -2.8298850 -17.4342206 0048 3
5 9.6369513 0.6651455 0048 1
6 -4.3156922 -21.4274021 0048 3
>ggscatter(df, x = "X", y = "Y", color = "g"
# palette = c("#00AFBB", "#E7B800" )
)
image.png
作者：刘小泽
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