全人源单抗制备之（2）-- 噬菌体抗体库技术

治疗性抗体的发展经历了鼠源性抗体、嵌合性抗体、人源化抗体和全人源抗体等多个阶段（详细了解 单克隆抗体药物研发与市场现状，点击链接）。目前，全人源抗体是治疗性抗体发展的主要方向，而 噬菌体抗体库技术 的出现为人源性抗体的制备提供了良好的技术平台，逐渐成为目前获得人源性抗体的主要手段之一。与经典的杂交瘤技术（周期长达数月）相比，噬菌体抗体库技术可以直接略过动物免疫和细胞融合的步骤，因而 抗体制备周期短（7-9周）。但是该技术对 库容量要求较高，如果库容量较小，难以获得高亲和力的抗体。

1. 技术原理

噬菌体抗体库技术： 通过聚合酶链反应（PCR）扩增抗体的全套可变基因，通过噬菌体展示技术，把抗原结合片段（Fab段）或单链抗体（ScFV）表达在噬菌体的表面，经过“吸附-洗脱-扩增”过程筛选并富集特异性抗体。

噬菌体展示技术（phage display）： 是将外源编码多肽或蛋白质的基因通过基因工程技术插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框能正确表达，使外源多肽或蛋白在噬菌体的衣壳蛋白上形成融合蛋白，随子代噬菌体的重新组装呈现在噬菌体表面，可以保持相对的空间结构和生物活性。（由此衍生的 酵母展示技术 也是同理）

2. 技术流程

2.1 构建噬菌体抗体库

常用的cDNA法：利用 cDNA 法获得基因片段并进行噬菌体展示文库构建的操作流程为，提取目标细胞的 mRNA ；逆转录得到 cDNA ；设计合适引物，以 cDNA 为模板，PCR 得到基因序列（类似于，从B淋巴细胞中以mRNA为模板扩增，获得抗体的H链和L链基因文库）；将基因克隆至噬菌体载体中；电转感受态细胞，辅助噬菌体超染； 收集上清，上清即为噬菌体展示文库。

噬菌体抗体库 通常依赖于重轻链随机组合，形成 非自然的VH-VL抗体配对，这也是该方法的局限所在。

图1. 噬菌体展示文库构建流程

噬菌体抗体库的种类根据 噬菌体类型、 载体类型、引入抗体多样性的方式不同而异

图2. 噬菌体抗体库的种类

2.2 噬菌体抗体库筛选

常用的生物淘洗法：以靶蛋白为固定相，以噬菌体展示文库为流动相，经过一段时间的共同孵育后，洗去未结合的游离噬菌体，然后以竞争受体或酸洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体，洗脱的噬菌体感染宿主细胞后经繁殖扩增，进行下 一轮洗脱，经过 3 轮～5 轮的“吸附-洗脱-扩增”后，即可得到与靶蛋白具有高亲和性的抗体。

图3. 噬菌体抗体库的筛选

2.3 技术优势

与传统的杂交瘤技术相比，噬菌体展示技术的优势如下：

图4. 噬菌体展示技术优势汇总

3. 诺奖故事

2018年的 诺贝尔化学奖，由“化学家--Frances H. Arnoid”，“化学家--George P. Smith”，“生物学家--Sir Gregory P. Winter”共同获得，以表彰他们在工业酶开发和单抗药制备中的卓越贡献。

3.1 酶的定向进化

Frances H. Arnoid从1993年起，进行了酶的第一次定向进化，这是一种催化化学反应蛋白质。她的方法经常用于开发新催化剂，用这种方法产生的酶，用途包括开发更环保的化学物质、药品以及生产更环保的可再生燃料。

可能考虑到颁奖的奖项毕竟是 “诺贝尔化学奖” ，Arnoid因此分得此次诺奖的50%奖金。

图5. Frances H. Arnoid--酶的定向进化

3.2 噬菌体展示技术

1985年，Smith开发出了一种被称为 噬菌体展示 的技术，该方法基于专门感染细菌的噬菌体病毒。这些病毒本身只不过是包裹着遗传物质的蛋白质胶囊。通过将基因导入噬菌体，Smith可以在噬菌体中演化出新型蛋白质。

该技术为后续抗体药研发奠定了基础，Smith因此分得此次诺奖的25%奖金。

图6. George P. Smith--噬菌体展示技术

3.3 噬菌体展示技术用于抗体药研发

Winter则应用噬菌体展示技术制造出全球首款全人源的单克隆抗体药物Humira（阿达木单抗）：
它是全球首个获批FDA上市的全人源抗肿瘤坏死因子ɑ（TNF-ɑ）单克隆抗体，能特异性地与可溶性人TNF-ɑ结合并阻断其与细胞表面TNF受体p55和p75的相互作用，从而有效地阻断TNF-ɑ的致炎作用。除此之外，阿达木单抗还可能通过结合跨膜TNF-ɑ，产生诱导细胞凋亡等效应，清除一部分致病的靶细胞。该药物目前用于类风湿关节炎、强直性脊柱炎的治疗。

图7.Sir Gregory P. Winter-- 将菌体展示技术用于抗体药研发

Humira（阿达木单抗）有多牛？自2012年之后，阿达木单抗就一直雄居全球处方药销售额的榜首，连续近十年为名副其实的“药王”（2019年销售额高于PD1的O药和K药总和）

图8. 阿达木单抗简介