内皮来源的基质细胞参与造血骨髓微环境形成

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文章题目：Endothelium-derived stromal cells contribute to hematopoietic bone marrow niche formation
期刊：Cell Stem Cell
日期：2020年4月
DOI：https://doi.org/10.1016/j.stem.2021.01.006

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摘要

骨髓基质细胞（BMSC）在组织维持和再生中起关键作用。然而它们的起源并不完全清楚。在这里，研究者在人胚胎和再生骨髓中鉴定出一种共同表达内皮和基质标志物罕见的LNGFR⁺ 内皮细胞。这种内皮细胞亚群拥有和内皮-间充质转化(EndoMT)一致的转录重编程能力，并能在移植后形成多能基质细胞，重建骨髓造血微环境。对小鼠的单细胞转录组学与谱系追踪证实了，内皮-间充质转化对骨前体和造血微环境池具有重要作用。IL-33在EndMT细胞亚群中高表达，并通过ST2受体信号驱动这种转化过程。这些数据证明了小鼠和人内皮细胞能生成具有组织形成潜力的BMSC，并可能对探究人类组织再生的方法提供理论指导。

图片摘要

数据

从小鼠胚胎骨髓分选的17000个骨髓基质细胞和内皮细胞进行单细胞转录组测序，测序平台是10X，然后进行质控，降维聚类等一系列的分析。数据编号E-MTAB-9994

结果解读

1. 人类胚胎和再生骨髓中鉴定出稀有的LNGFR⁺ 细胞，具有内皮和基质细胞特性

作者团队曾发现，在人类胎儿发育和损伤后的骨髓再生中发现一种独特的CD105 (endoglin)+内皮细胞（ECs）亚群，又叫人类再生相关的内皮细胞（hRECs）。对这些ECs进行转录组分析发现，一些与基质细胞命运相关的转录本，如THY1（CD90）和NGFR（CD271）大量表达。于是推测，在人类胚胎发育过程中可能存在一个具有基质细胞特性的hRECs亚群，其中LNGFR（由NGFR编码的蛋白）是已知的人类原代骨髓基质细胞标记物。后续研究发现这类LNGFR⁺ EC并不存在成年人骨髓当中，却在胎儿骨髓和急性白血病患者化疗17天后骨髓（AML17）中大量存在。人类胎儿骨骼共聚焦成像进一步显示，位于小梁区域的窦状内皮中存在CD31⁺CD271⁺CD105⁺ 细胞。这些数据表明，一种稀有的LNGFR⁺ ECs 存在于人类骨骼和骨髓中，在发育和再生过程中出现频率显著增加。

图1

图1. 鉴定人类胚胎和再生骨髓中稀有的LNGFR阳性内皮细胞

由于这类内皮细胞共表达内皮细胞和间质标记物，提示它们可能发生了内皮细胞向基质细胞表型的转变（EndMT）。随后作者分选出CD31^- LNGFR⁺ BMSCs，LNGFR^- hRECs和 LNGFR⁺ hRECs， 并进行转录组测序。PCA分析发现内皮细胞和基质细胞群体明显存在独立聚类。其中，LNGFR⁺ hRECs聚集在LNGFR^- hRECs和CD31^- LNGFR⁺ 基质细胞之间；随后分析发现LNGFR⁺ hRECs与LNGFR^- hRECs相比较内皮基因明显下调，而基质细胞标记基因明显上调；GSEA分析得出EndMT相关基因在LNGFR⁺ hRECs中是显著富集的；同样一些重要关键的EndMT调节因子也在LNGFR⁺ hRECs显著表达。这些结果表示LNGFR⁺ hRECs具有与发生间质转化的ECs一致的分子特征，并可能具有原始间质细胞分化潜能。

图2

图2. LNGFR+内皮细胞表现经历间充质转化细胞的转录特征

2. LNGFR+ hRECs通过EndMT生成eBMSCs，具备多向分化潜能

在鉴定完LNGFR⁺ hRECs的存在，并提出假设其可能通过EndMT分化为BMSCs。首先，作者将分选出的LNGFR⁺ hRECs在体外进行诱导培养，这些细胞表现出多能基质细胞的特性，并且可以进一步诱导分化为成骨、软骨、脂肪和造血干细胞等。这些结果提示LNGFR⁺ hRECs具有转化为基质干细胞样细胞的能力，推测这些细胞具备分化成各类骨系细胞、支持新生造血等潜能，从而参与骨髓发育。通过一系列的实验作者发现，LNGFR⁺ EC来源的基质细胞群能够在体内进行多向成骨分化和形成造血微环境能力。

图3

图3. 人内皮来源的基质细胞（eBMSCs）具有建立在体内造血微环境的能力

3. eBMSCs是造血微环境细胞群中一类独特亚群

由于单细胞测序可以比较细胞亚群内在联系。因此，作者从17天胎龄的小鼠胚胎中分选出内皮细胞和BMSCs进行scRNA-seq分析，发现存在一簇同时表达内皮和基质特异性基因的细胞亚群，并且这类细胞富集表达EndMT相关基因。拟时态轨迹分析，结果发现EndMT细胞(图中细胞簇4)大多富集于位于ECs和BMSCs之间的分支，证实了EndMT细胞群确实来源于ECs并且是BMSCs分化过程中的中间态这一猜想。随后，作者通过使用内皮细胞谱系示踪工具鼠揭示了BMSCs来源于ECs，同时还鉴定出成骨/软骨谱系细胞(OLCs)也来源于ECs。同时，作者又比较了各亚群细胞(ECs来源或非来源的BMSCs和OLCs)的RNA-seq数据，得到了一致的结果。结果表明，在小鼠骨髓中存在一群内皮细胞来源的基质细胞亚群，它们表达着一些重要的造血干细胞调控因子，有助于成骨和造血微环境形成。从而证实了人类LNGR⁺ eBMSCs 具有成骨和骨髓组织、支持造血的潜力。

图4

图4. scRNA-seq鉴定小鼠骨髓发育过程中内皮-间充质转化细胞

4. IL-33通过诱导内皮细胞EndMT 分化为eBMSCs

首先作者发现IL-33在LNGFR⁺ hRECs中显著高表达，随后分别在人脐静脉内皮细胞（HUVECs）和人外周血分离的内皮集落形成细胞（endothelial colony-forming cells, ECFC）中证明IL-33能够诱导EndMT，并且相关EndMT基因显著上调；同时，作者通过一系列的实验验证了IL-33诱导的ECs具有BMSCs特性；并通过阻断实验，证实上述这些改变至少部分是通过ST2- SNAI2信号途径实现，因为通过使用针对ST2的中和抗体进行阻断会导致IL-33介导的EMT的部分恢复。

图5

图5. eBMSC促进小鼠造血微环境的形成

结论

哺乳动物骨髓基质细胞在组织维持和再生中发挥关键作用，然而我们对于这种细胞的发育和起源仍不完全清楚。本研究通过人类和小鼠的综合实验，包括内皮细胞亚群的细胞和转录特征，遗传谱系追踪，单细胞轨迹分析以及离体机制研究，证实了组织修复/再生状态下，内皮细胞可在IL-33诱导下转化生成骨髓间质细胞BMSCs，参与造血以及组织修复。而内皮细胞是否转变为具有多谱系组织分化的真正的基质干细胞，或产生具有不同受限的分化能力的异质基质干/祖细胞群，这些能力是否又以复合方式促进骨髓的形成，尚待充分阐明，需进行进一步深入研究。此外，IL-33对体内驱动内皮-间充质转化发生在发育中还是发生在再生中，仍尚待充分阐明。

本文亮点

• 人体骨髓存在一类内皮细胞和基质细胞标记共表达的亚群
• 这些细胞通过EndoMT产生，能够形成造血龛
• 内皮来源的骨髓间充质干细胞是小鼠造血龛细胞的一个独特的亚群
• IL-33驱动人内皮细胞向基质细胞的转化