单细胞分析之细胞交互-6：NicheNet使用的常见问题汇总

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常用的细胞通讯软件：

• CellphoneDB：是公开的人工校正的，储存受体、配体以及两种相互作用的数据库。此外，还考虑了结构组成，能够描述异构复合物。（配体-受体+多聚体）
• iTALK：通过平均表达量方式，筛选高表达的胚体和受体，根据结果作圈图。（配体-受体）
• CellChat：CellChat将细胞的基因表达数据作为输入，并结合配体受体及其辅助因子的相互作用来模拟细胞间通讯。（配体-受体+多聚体+辅因子）
• NicheNet // NicheNet多样本分析 // 目标基因的配体和靶基因活性预测：通过将相互作用细胞的表达数据与信号和基因调控网络的先验知识相结合来预测相互作用细胞之间的配体-靶标联系的方法。( 配体-受体+信号通路）
  附：NicheNet使用的常见问题汇总

其它细胞互作软件还包括Celltalker，SingleCellSignalR，scTensor和SoptSC（这几个也是基于配体-受体相互作用）

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1.什么情况下可以使用NicheNet进行细胞通讯分析？

NicheNet 可以用于研究配体如何影响假定相邻或者相互作用的细胞群中的基因表达情况，并根据其作用对最重要的配体进行优先排序。需要提供不同条件或者状态下，接受信号的细胞群（receiver cell）中的差异基因列表，通常认为这些基因的差异表达是sender信号细胞群中的配体导致的 。因此，可以是同一类型细胞在不同条件下的差异表达基因，也可以是两种细胞类型之间的差异表达基因，例如，如果它们是祖细胞和分化细胞类型，其中分化受微环境的影响。

2.如果没有相应的条件或者状态来对细胞群进行区分， 只有稳态数据，是否可以采用NicheNet来进行分析？

如果只对稳态条件下的配体 - 受体相互作用感兴趣（并且只有稳态条件数据），可以采用CellphoneDB 等其他一些工具来实现， 不建议将NicheNet应用于稳态数据，主要是由于不存在一组明确地受细胞间通讯过程影响的基因，从而可能导致错误地将配体与一些“细胞内在”基因进行关联。

3.是否可以将通过 FindMarkers 函数找到的 Seurat 聚类标记基因作为感兴趣的基因集?

一般情况下不建议使用， 如果使用接受信号的细胞群（receiver cell）cluster 的标记基因作为感兴趣的基因集，默认假设ccluster特异性基因是由细胞与其他细胞类型的细胞相互作用诱导的。然而， 在大多数情况下，许多cluster特异性基因反映了细胞类型特异性基因表达程序，它是“细胞内在”基因表达程序的一部分，并不完全受环境因素的影响。或者换句话说，cluster标记的大多数基因可能并没有真正被来自相互作用细胞的配体诱导/调节，因此在这个基因集上使用 NicheNet 并不理想。

在这种情况下使用 NicheNet 将增加将配体错误连接到某些“细胞内在”基因的机会。有一个例外情况，那就是如果研究的是 2 个细胞类型相同的cluster，但一个cluster在组织中的位置不同，因此具有不同的细胞外影响，那么这些cluster之间的 差异基因并不反映细胞类型的差异，而是影响细胞间相互作用的差异细胞类型。在这种情况下，可以使用 NicheNet。例如，一个祖细胞cluster在细胞间相互作用的影响下分化成另一个细胞cluster，这种情况下可以在该分化细胞群的特定cluster基因上使用 NicheNet，以检查细胞间相互作用对该分化过程的影响。

4. 如果比较 NicheNet 与 CellphoneDB 的优先配体-受体相互作用，发现几乎没有重叠。 这怎么解释？

一个主要原因是这两种工具在优先考虑配体-受体相互作用的时候有不同的目标。 CellphoneDB 的目标是找到细胞类型特异性的配体-受体对。因此，如果想研究不同细胞类型的潜在差异相互作用，CellphoneDB 是理想的选择。 CellphoneDB 首先寻找相互作用细胞之间所有表达的配体-受体对。然后它通过查看配体和受体的表达来找到细胞类型特异性配体-受体对。在sender/receiver细胞群中表达的配体/受体越强、越特异性，通过 CellphoneDB 分析对其进行优先排序就越好。

NicheNet 的目标与 CellphoneDB 的目标相辅相成。 NicheNet 希望找到最有可能调节受体细胞中基因表达的配体-受体对。因此，它会寻找数据中存在信号相互作用证据的配体-受体对。与 CellphoneDB 相比，这可能会提供更多的功能信息（您对配体-受体相互作用的下游目标有所了解），但也会提供一些关于哪些相互作用可能真正活跃的线索。这是因为配体和受体在 RNA 水平上的表达（由 CellphoneDB 发现）并不一定意味着它们在现实中相互作用。如果观察到这种相互作用的下游信号效应，例如通过 NicheNet，有更多证据表明这种互动可能在现实中发生。因此，就像 CellphoneDB 一样，NicheNet 开始在感兴趣的相互作用细胞之间寻找所有表达的配体-受体对。但是，NicheNet 不是通过查看表达强度来对它们进行优先级排序，而是根据receiver细胞中观察到的目标基因对它们进行优先级排序。这种方法的一个可能缺点是可以返回一些表达相对较低的配体-受体对。因此，我们还建议在 NicheNet 优先排序后检查配体及其受体的表达。举个例子：如果在 200 个中排名第 7 的配体比根据配体活性排名第 1 或第 2 的配体表达的要强得多，那么这个表达更强的候选配体可能更有趣！

因此，在将 NicheNet 与 CellphoneDB 输出进行比较时，预计会出现以下差异。由 NicheNet 而不是由 CellphoneDB 拾取的配体-受体对可能或普遍表达或相当低表达，但有一些“信号证据”。由 CellphoneDB 而不是由 NicheNet 挑选的对将强烈地表达细胞类型特异性，但没有证据表明基于对信号通路的先验知识这些对实际上是有功能的。当然，缺乏证据并不意味着没有信号正在发生。

5. 当根据 NicheNet 检查一些顶级配体的表达时，发现其中一些配体和/或其受体的表达量真的很低是什么原因？NicheNet 不考虑细胞的表达数据吗？

NicheNet对配体的优先排序（配体活性分析）仅基于其靶基因在受体细胞中差异表达的一组基因中的富集发生。因此，没有基于配体在sender细胞中的表达强度或受体在receiver细胞中的表达强度的优先级。sender细胞中的表达仅用于确定哪些配体在sender细胞中表达，而在receiver细胞中的表达用于确定哪些受体在receiver细胞中表达。 “正在表达”的默认定义是基因应该在感兴趣的簇中 10% 的细胞中表达。这不是那么高（如果需要，您可以设置更严格的截止值），导致可能的结果是，根据其靶基因的富集度排名靠前的配体实际上不是非常高表达。因此，根据 NicheNet 如何优先考虑配体，可以预期您所观察到的情况。

在当前版本的 NicheNet 中，因此不直接包含表达强度，因为我们发现很难在配体活性和表达之间进行权衡。但由于表达水平很重要，我们建议在 NicheNet 优先排序后检查配体及其受体的表达。举个例子：如果在 200 个中排名第 7 的配体比根据配体活性排名第 1 或第 2 的配体表达的要强得多，那么这个表达更强的候选配体可能更有趣！

参考：https://github.com/saeyslab/nichenetr/blob/master/vignettes/faq.md