Guo Wei et al. Tumor microbiome contributes to an aggressive phenotype in the basal-like subtype of pancreatic cancer.[J]. Communications biology, 2021, 4(1).
胰腺导管腺癌（Pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC）是胰腺癌最常见的一种类型，是世界第三大致死癌症。大多数PDAC患者预后不佳，5年总生存率只有9%。手术切除是PDAC治疗的主要选择，但复发率相对较高，大多数患者最终会因癌症转移而死亡。
在过去20年，胰腺癌已经被认为是一种炎症驱动的肿瘤，先天性免疫和适应性免疫的不同细胞亚群通过各种机制共同促进肿瘤的发生，但是炎症致病的确切机制还不清楚。此外，PDAC中的基底样亚型，相对其他亚型预后更差、侵袭性更强；为探究炎症致病机制和临床表型的异质性，研究从胰腺癌肿瘤内微生物入手，从宿主遗传因素、微生物组组成以及微生物组基因功能等方面，探究特定微生物组在诱导炎症中的潜力以及对胰腺癌表型的影响。
本研究的样本是62例手术切除的不同分子亚型的PDAC，对宿主遗传特征和肿瘤微生物组进行了全面分析。
结果1：基底样亚型PDAC显示激活的抗菌免疫和炎症反应
胰腺癌的分子分型已被多项研究证实，不同的肿瘤亚型具有不同的预后。为探究肿瘤进展异质性的原因，研究使用Chan-Seng-Yue等人（Chan-Seng-Yue, M. et al. Transcription phenotypes of pancreatic cancer are driven by genomic events during tumor evolution. Nat. Genet. 52, 231–240 (2020).）分型方案中的4个特征基因集对队列中62个PDAC样本的肿瘤亚型进行聚类（图1a）。累积分布函数（Cumulative distribution function, CDF）显示，聚类数k=2对数据集拟合不足，而k=4或5则过拟合（图1b）。因此，最终选择k=3作为最佳的聚类数，将队列中的样本划分为三种主要的肿瘤亚型，即基底样亚型、混合亚型和经典亚型。
Michelle等人将特征基因集2和10定义为基底样型特征基因集，特征基因集1和6中的基因对应于Michelle等人和Moffitt等人描述的经典型特征基因集。为了验证聚类的合理性，再次应用Moffitt等人的分型模型对样本进行分类，得到了几乎相同的分型结果（图1c）。
通过比较基底样亚型和经典亚型的基因表达，共发现2100个基因具有显著差异，其中679个基因在基底样亚型中表达上调（图1d）。对差异表达基因进行GSEA分析显示，基底样亚型在DNA复制（E2F靶点、G2/M检查点和MYC靶点）、TGF-β信号、上皮间质转化（EMT）和炎症反应等方面富集（图1e）。这些发现表明基底样亚型肿瘤具有更强的侵袭性表型。
另外，TNFα和干扰素-γ反应的增加反映机体处在激活的抗菌免疫状态，为了解不同肿瘤亚型的免疫浸润是否存在差异，研究使用CIBERSORTx评估每个样本的免疫细胞分布，发现记忆B细胞、滤泡辅助性T细胞和激活的肥大细胞的水平在基底样亚型的肿瘤中显著升高（图1f）。
这些数据结果提示基底样亚型肿瘤的侵袭性可能与病原体引起的过度免疫反应和炎症有关。
结果2：基底样肿瘤具有独特的微生物群落
为探究不同亚型肿瘤的异质性，采样宏基因组测序对肿瘤内的微生物组进行研究。样本队列中共鉴定得到365个不同的微生物属，菌群丰度较高的前15个类群在不同样本和不同亚型中的相对丰度通过百分比堆积柱形图进行了展示（图2a, b）。不同亚型肿瘤中优势菌群组成相似，但丰度具有差异。其中最优势的假单胞菌属（Pseudomonas）与感染相关，且已被证明与PDAC患者的短期生存有关。
为进一步研究不同肿瘤亚型的微生物组成，使用丰富度（观察到的分类单位单元数目）、Shannon多样性指数和Bray-Curtis多样性度量距离来测量肿瘤微生物多样性（图2c）。基底样亚型肿瘤的微生物群落丰富度显著高于经典型和混合型（p = 0.0017和p = 0.0026），而基底样亚型的Shannon指数显著低于经典型（p = 0.017）。基底样亚型丰富度增加，Shannon指数降低，说明虽然微生物群落组成丰富，但以少数丰富度极高的物种为主。此外，基底样亚型的Bray-Curtis不相似性远高于经典型和混合型。PCoA分析显示，肿瘤样本存在明显的、不同亚型的聚类，即基底样亚型和经典型/混合型。
基于这些数据结果，推断肿瘤微生物可能在一定程度上促成了PDAC亚型的异质性。
结果3：基底样亚型PDAC肿瘤微生物组显著富集
肿瘤微生物组成与PDAC亚型之间的关系启发研究者进一步探索相关微生物。在关注的属水平上的微生物特征方面，经典型和混合型肿瘤的微生物组组成相似，但是基底样亚型肿瘤具有相对差异的微生物组组成。共鉴定得到83个微生物属在不同肿瘤亚型中丰度显著不同，这些属中，大多数在基底样亚型肿瘤中显著富集，可能是基底样亚型的潜在微生物群落特征。相比之下，在经典型/混合型肿瘤中富集的微生物只有在特定病例中才高度富集，表明这两个亚型没有明显的微生物组特征（图3a, b）。热图可以清楚地表明基底样亚型的肿瘤可以被区分。在基底样亚型中丰富的微生物属中，不动杆菌（Acinetobacter）、假单胞菌（Pseudomonas）和Sphingopyxis得到了关注（图3c-e）。这三个属的细菌在基底样亚型肿瘤中明显富集，提示它们可能影响肿瘤的进展。根据这三个细菌属丰度将PDAC患者分为高组和低组，高组的PDAC患者预后更差（图3f-h）。为进一步揭示在PDAC中发挥关键作用的关键物种，研究者对这3个属细菌的种水平进行了探究，共鉴定得到4种不动杆菌、7种假单胞菌和5种Sphingopyxis，为预后的预测提供参考。
同时，补充了16S rRNA荧光原位杂交实验（fluorescence in situ hybridization, FISH）、抗细菌脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）抗体免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC）实验和16S rDNA PCR等实验，验证胰腺内细菌的存在不是实验室污染物。
结果4：基底样肿瘤中富集的微生物群落具有诱导炎症的潜力
由于微生物基因组数据库不完整，许多未知微生物无法被识别，研究人员尝试构建胰腺肿瘤微生物基因目录，以助于揭示PDAC患者肿瘤微生物组的潜在作用。基于非人读序从头组装和构建宏基因组contigs，并进行基因预测，建立无冗余的微生物基因目录。目录包含229,282个基因，平均长度为530 bp。经过计算和检验，绝大多数差异基因在基底样亚型肿瘤中特异性富集。基于8960个基底样亚型肿瘤富集的基因的热图显示，基底样亚型和经典亚型/混合亚型存在相对明显的分层（图4a）。
为进一步探究微生物基因在肿瘤进展中的作用，使用KEGG ortholog （KO）和eggNOG ortholog groups（OG）对基因进行功能鉴定。结果显示，基底样亚型的肿瘤微生物在代谢（氨基酸、核苷酸、碳水化合物和脂类的运输和代谢）、能量生产和转化、复制、防御机制和细胞膜/包膜生物发生等方面表现出富集(图4b)；在2级KEGG功能分类下，基底样亚型的肿瘤微生物富集到的基因在代谢水平、细胞运动性和抗微生物药物耐药性等功能中的表达水平提高（图4c）；这反映出更高的致病性和更恶劣的微生物环境。这些发现揭示了基底样亚型相关微生物具有诱发炎症的潜力，有助于阐明特定微生物在癌变中的作用。
结果5：基底样肿瘤中的微生物群与致癌基因表达程序相关
肠道微生物可以通过影响宿主基因的组织特异性表达来影响肠道生理功能和肠道疾病。为探究属水平微生物与宿主基因功能模块之间的关系，对此进行了相关性分型。首先将图1d中鉴定到的差异表达基因构建成21个功能模块，这些基因模块在KEGG通路、GO类别或特征基因集中表现出显著的富集。关联分析表明，不动杆菌属、假单胞菌属、Sphingopyxis等微生物属与菌源分子应答、脂多糖应答、补体系统应答功能模块呈正相关，反映出宿主免疫的天然抗菌反应。此外，还发现许多癌症相关功能，如Kras信号、EMT和MAPK信号通路也与上述细菌呈正相关。但这些细菌的丰度与胆汁酸代谢、胰腺β细胞和胰腺分泌相关的宿主功能呈负相关（图5a）。
从这个初步结果中研究人员又提出一个精细化的相关网络，概述4种宿主功能和3个关键细菌属之间的关系，显示宿主和细菌间明显的相互作用。不动杆菌、假单胞菌和Sphingopyxis丰度增加，激活机体对细菌病原体的响应，且丰度增加与DNA复制、Kras信号转导呈正相关，与胆汁酸代谢呈负相关（图5b）。这些数据结果揭示了肿瘤微生物组对宿主细胞功能的影响，支持肿瘤微生物组在肿瘤发生中发挥重要作用。
结果6：宿主遗传变异与微生物组组成具有相关性
人体内微生物的组成因个体而异，并已被证明与宿主遗传变异密切相关。为探究PDAC患者遗传因素对微生物组成的影响，根据DNA测序数据对每个个体进行全基因组基因分型。使用Jaccard距离估计个体之间的遗传差异，Jaccard距离是一种衡量两组基因差异程度的方法，范围从0到1。并将微生物beta多样性（Bray-Curtis度量距离）与遗传不相似性（Jaccard距离）进行了相关性研究，二者显著正相关（图6a）。这表明具有相似遗传变异的个体拥有相似的微生物组成，支持宿主遗传因素可能在微生物组组成方面存在影响。
为进一步探究与微生物组调控相关的关键遗传变异，研究人员对遗传变异与属水平微生物之间的关联进行了有针对性的分析。共鉴定出134个关联对，涉及97个SNV和29个属（图6b）。显著性最强的变异位于21号染色体第10,440,242位，即BAGE基因的内含子区域，与Paucibacter属的丰度有关。值得注意的是，一些与基因CXCL1相关的SNV与细菌丰度显著相关。再使用较不严格的阈值重新筛选与微生物相关的SNV，共有39个基因从这些位点中鉴别出来。
以免疫应答相关基因作为背景，进行GO和KEGG富集分析。GO富集分析表明，潜在的调控微生物基因参与了干扰素-γ介导的信号通路和肽抗原结合；KEGG通路则主要富集在卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、自然杀伤细胞介导的细胞毒性和TNF信号通路（图6c, d）。
为更好地将宿主与微生物的互作可视化，研究人员制作了一个由6个功能和25个微生物属组成的相关网络（图6e）。
综上发现表明免疫相关的功能改变可能与微生物组组成有关，遗传变异可能也与微生物群落存在关系。
总结
本研究聚焦于PDAC中肿瘤微生物组诱导的持续性炎症的作用，并提出基底样亚型激活的炎症反应在胰腺癌发生中起促进作用。详细说明了宿主细胞功能和肿瘤微生物组之间的相互作用，提示特定微生物组组成可能存在致瘤作用。此外还证明了宿主遗传因素对PDAC微生物组存在影响。本研究强调了PDAC异质性的微生物基础，为患者预后预测指标和治疗方法提供了新思路。
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