m5C是RNA百余种修饰中研究较多的一种。m5C存在于tRNA上时，可以对翻译进行调节；存在于rRNA上时，可以对核糖体的生物合成进行质控；存在于mRNA上时，则可以影响mRNA的结构、稳定性及翻译过程。
常规mRNA m5C甲基化测序（RNA-BS）：
mRNA分离后首先通过亚硫酸盐处理，非甲基化的C转变为U，m5C修饰的碱基保持不变，结合高通量测序，可以对RNA上的每一个C碱基修饰进行定位与定量。
常规mRNA +lncRNA m5C甲基化测序（全转录组RNA-BS）：
m5C RNA甲基化测序，去除人rRNA后，剩余RNA经重亚硫酸盐处理后，结合高通量NGS策略，可在全转录组范围内单碱基分辨率地检测基因m5C甲基化修饰分布。
技术优势：
高深度：超高深度重亚硫酸盐处理，检测准确性极高；
高通量：结合高通量NGS，全转录组范围内检测；
单碱基：单碱基分辨率，快速检测和分析RNA中的m5C。
高准确：精确的检测mRNA等每一个C碱基的的修饰水平。
研究方向：
与m6A甲基化类似，m5C甲基化已被证明与肿瘤、神经系统紊乱、代谢性疾病、病毒感染以及个体发育等密切相关。
此外，RNA甲基化（m5C）与人类疾病密切相关，其功能涉及调控干细胞应激、细胞毒性应激、mRNA出核和植物细胞发育及基因表达等方面。
技术路线：
实验策略：
分析内容：
送样要求：
经典案例
一、斑马鱼：m5C修饰在生理和病理进程中的重要调控作用
2019年8月，在Molecular Cell（17.97）发表的RNA 5-methylcytosine facilitates maternal-to-zygotic transition through preventing maternal mRNA decay文献，研究了5-甲基胞嘧啶（m5C）如何参与调控母源mRNA稳定性维持，发现m5C通过新结合蛋白Ybx1调控母源mRNA的稳定性，进而调控斑马鱼母源-合子转换（maternal-to-zygotic transition, MZT）及早期胚胎发育进程。通过绘制斑马鱼早期胚胎发育过程中RNA m5C甲基化图谱，发现在母源-合子转换过程中，m5C修饰的母源mRNA比未修饰的mRNA更稳定。研究结果揭示：m5C修饰通过其结合蛋白Ybx1招募Pabpc1a维持母源mRNA稳定性从而保证母源-合子转换有序机制的发现，进一步证明其在调控重要生理和病理进程中的重要作用。
二、肿瘤：单碱基分辨率下分析人类膀胱尿路上皮癌(UCB)样本中mRNA的m5C修饰
2019年，发表在Nature Cell Biology（IF: 28.824）上的5-methylcytosine promotes pathogenesis of bladder cancer through stabilizing mRNAs的文章，通过单碱基分辨，分析人类膀胱尿路上皮癌(UCB)样本中mRNA的5甲基化胞嘧啶（m5C）修饰，鉴定出大量的癌基因mRNA携带高甲基化m5C修饰位点，并且高甲基化修饰基因在UCB样本中呈现高表达。此外证明，YBX1可以特异性的识别m5C位点（Reader），YBX1通过募集ELAVL1蛋白维持靶向mRNA的稳定性。此外发现，NSUN2和YBX1通过结合HDGF基因3’端非编码区域的m5C位点驱动UCB的发病机制。本文揭示了m5C mRNA修饰对癌基因激活调控的新机制，也为不同肿瘤研究提供了新思路和潜在的治疗策略。
三、哺乳动物：m5C修饰在mRNA出核和转录后调控中发挥重要作用
2017年，发表在Cell Research（IF: 25.617） 上，题为5-methylcytosine promotes mRNA export — NSUN2 as the methyltransferase and ALYREF as an m5C reader的研究发现，m5C修饰在富含CG的区域和翻译起始位点下游的区域富集，在哺乳动物转录组中具有保守的、组织特异性的和动态的特征。此外，mRNA中m5C的形成主要是由RNA甲基转移酶NSUN2催化的，且m5C在体内是由mRNA运输因子ALYREF特异性识别。NSUN2调节ALYREF的核-质穿梭、RNA结合亲和力和相关mRNA的出核。该研究提供了哺乳动物转录组的m5C的全面概况，并表明m5C修饰在mRNAc出核和转录后调控中发挥重要作用。
四、人细胞：重亚硫酸盐处理结合高通量NGS策略，单碱基分辨率检测(h)m5C修饰分布
2021年，发表在RNA Biology（IF: 4.652）上，题为Bisulphite miRNA-seq reveals widespread CpG and non-CpG 5-(hydroxy)methyl-Cytosine in human
microRNAs文章，通过重亚硫酸盐处理结合高通量NGS策略，以单核苷酸分辨率系统地分析miRNAs中的(h)m5C，即BS-miRNA-seq，单核苷酸分辨率系统地检测了人类细胞系和人外周血单核细胞(PBMC)中miRNAs上的(h)m5C修饰，并通过开发的专用的分析流程(MAmBA)分析了样本中的(h)m5C甲基化图谱，发现(h)m5C是人miRNAs中广泛存在的修饰，并不局限于CG序列，并且通过m5C和hm5C的抗体免疫沉淀验证了实验结果，也首次表明了人类miRNA包含hm5C修饰。
参考文献：
① Yang Y, et al.RNA 5-MethylcytosineFacilitates the Maternal-to-Zygotic Transition by Preventing Maternal mRNADecay. Mol Cell. 2019 Sep 19;75(6):1188-1202.e11.
② Chen X, et al.5-methylcytosine promotespathogenesis of bladder cancer through stabilizing mRNAs. Nat Cell Biol. 2019Aug;21(8):978-990.
③ Yang X, et al.5-methylcytosine promotesmRNA export - NSUN2 as the methyltransferase and ALYREF as an m5C reader. CellRes. 2017 May;27(5):606-625.
④ Carissimi C, et al.Bisulphite miRNA-seqreveals widespread CpG and non-CpG 5-(hydroxy)methyl-Cytosine in humanmicroRNAs. RNA Biol. 2021 Dec;18(12):2226-2235.