动植物重测序--BSA

BSA（Bulk Segregant Analysis）

针对目标性状，选择表型极端差异的亲本构建家系，对该家系目标性状表型极端的子代分别混合得到的两个样本池进行全基因组重测序，检测到的两池间DNA差异片段即为候选区域，可进一步定位到目标性状相关的基因或标记。利用该方法，可以快速的对单一性状进行精细定位，加速目标性状的功能基因组研究进程。

BSA基本原理

对，BSA最主要的要求就是研究的这个性状在亲本和子代中一定是极端差异，这样结果才能更准确。

BSA测序方案

样本要求：2个亲本+2个子代池（每个子代池≥20个样本）（200mg组织够提DNA即可）

文库类型：WGS文库（有参）

测序数据量：亲本10x/个，子代池≥20x/池（若子代池混样30个，就测30x）

子代池选择：家系群体（F2，RILS，BC，DH等）

BSA影响因素

1）参考基因组：参考基因组组装质量好坏以及注释是否完全对BSA结果有一定的影响。建议尽量选择组装至染色体水平，且基因组注释较完全的参考基因组。

2）分离群体：理论上任何一对具有相对性状的亲本杂交后产生的分离后代都适用于集群分离分析法。但常用的分离群体为：F2代群体、回交群体、重组自交系、双单倍体群体。

3）亲本选择：亲本间目标性状要求差异显著，尽量选用纯度高的亲本，并进一步通过自交进行纯化；并且，除了关注的1个目标性状外，其他性状尽量一致，无其他性状发生分离。

4）混池个体数：混池的样本数通常选取极端性状（群体总样本数的5～10%内）的个体进行混池。混池中若极端性状个体数太少，可能造成样品数不够，不具备代表性；若样本数过高可能会引入杂合个体，产生干扰。

5）表型统计：表型统计不准确，或表型由多个微效基因控制，可能会引起定位效果不佳。

BSA常见问题

1、群体完整度对定位效果的影响？

下表参考链接中有经验统计。2 亲本+2 子代池是最优选择，次之为⼀个亲本+2 个子代池；再次为 2 个亲本+1 个子代池； 1 个亲本+1 个子代池；最次为只有子代池，如果只有亲本，那么建议⽼师去做变异检测。若是mutmap（突变体与野生型杂交），则可提供1个野生型亲本+1个突变型子代池，或者两个子代池。不同群体的index算法原理上稍有不同。

2、如果该物种没有参考基因组怎么办？或者如果样品是两个品种的杂交后代，⽽两个品种都有参考基因组，该选择哪个参考基因组？

如果该物种没有参考基因组，⽽近缘物种有参考基因组，可以选择近缘物种的参考基因组进⾏⽐对分析。如果两个品种都有参考基因组，则要根据样品的表型和其他数据选择⼀个与样品差异较⼩的品种作为参考基因组。

3、如何构建混池？混池规模多⼤能够满⾜要求？

通过表型调查，筛选具有极端表型的个体构建两个混池，质量性状（1： 2： 1） 具有主效位点的数量性状（正态分布）。表型统计不准确，或由多个微效基因控制，会影响定位效果。混池个体性状不极端，存在较多中间型，同样会导致定位结果不佳。⼀般选择群体的 5%到 10%个体构建极端混池，建议极端样品在 30+30 以上。通常在样本量等情况允许的条件下越⼤越好，能够更进⼀步的缩⼩候选区域。具体需根据物种、样本情况等设计方案。

4、简化基因组测序适合做 BSA 性状定位吗？

针对微效多基因控制的数量性状，与⽬标性状相关的位点很多，简化基因组或许有幸捕获到少数位点，但绝⼤部分会被遗漏，这对后续的研究很不利。针对质量性状或由少数主效基因控制的数量性状，简化基因组 BSA 的⽅法风险更⾼。诺⽲致源不做简化基因组的 BSA性状定位。

5、能否保证定位到的候选区域的⼤⼩和候选基因的个数？

候选区域的⼤⼩和候选基因个数的多少，与群体的⼤⼩、亲本材料差异的⼤⼩、⽬标性状特点、测序深度的多少、分析物种的基因组⽔平等多项因素相关，因此不能给出统⼀的标准，但可以参考已完成的项⽬经验进⾏估计。

6、BSA 能否检测 SV、 CNV？

不建议⽤ BSA 的结果检测 SV、 CNV，第⼀、测序深度不够；第⼆、 BSA ⼦代是混池样本，混池样本做⼤结构变异检测误差较⼤，且没有分析意义； 想做⼤结构变异检测，建议⽤新技术做， Bionano、三代、 10X Genomics 或者测 30X ⼆代做分析。

SNP-index计算方法

BSA新方法- GradedPool-Seq（GPS）

该方法参考于2019年7月发表在《自然-通讯》（Nature Communications）杂志上发表了题为Dissecting a heterotic gene through GradedPool-Seq mapping informs a rice-improvement strategy 的研究论文。

文中将F2群体不同表型均进行了混池测序，100-150个个体/池，个体平均测序深度0.5x，测序数据比对，变异检测，SNP标记筛选，统计检验-背景降噪-定位。这个降噪后分析结果看上去要比SNP-index的结果简单很多，精度也会高。如果样本足够，经费阔绰，建议可以用这个分析方法尝试一下。

A）GPS定位QTL的流程；B)杂种优势基因定位及设计育种示意图（彩色圆点代表优良基因）

GPS分析结果展示

参考学习：

1、BSA你真得懂了吗? 

2、BSA的原理

3、GPS的论文报道