单细胞ATAC和单细胞基因表达的多组学结合的研究模式逐渐成为CNS文章的“标配”，已被广泛应用于肿瘤、疾病、神经科学、发育生物学及免疫等研究领域，引领着未来单细胞发展的主流趋势。研究思路 | 单细胞ATAC+基因表达多组学研究思路怎么破，一起来拍拍最新文章（上篇）中，一起探究了sc RNA-seq和sc ATAC-seq深度结合的文章思路，sc RNA-seq和sc ATAC-seq“双C”完美配合，“Carry”全场，深度解析生物进程中的基因表达模式的动态变化及其背后调控机制。本期带来以sc RNA-seq为“主角”、为“C位”，sc ATAC-seq为“配角”、为“辅助”的文章研究思路，快来看看吧！
不同临床试验的结果差异提示不同的化疗药物可能会导致不同的肿瘤微环境特征，进而影响免疫检查点抑制剂的治疗效果。在抗肿瘤免疫治疗中，系统地确定协调的免疫应答至关重要，单细胞技术的进步使全面表征肿瘤浸润免疫细胞的基本特征成为可能。
三阴性乳腺癌（TNBC）是复发率和死亡率最高的乳腺癌亚型。虽然免疫检查点阻断（ICB）在TNBC治疗中显示出希望，但近期临床试验表明，阿替利珠单抗（免疫治疗）联合紫杉醇（化疗）却无法使TNBC患者获益。该研究通过整合sc RNA-seq、sc TCR-seq和sc ATAC-seq，构建了TNBC患者肿瘤微环境和外周血来源免疫细胞的高分辨率转录组和表观组图谱，并阐明了免疫细胞在不同治疗方案下的动态变化，揭示anti-PD-L1免疫治疗联合紫杉醇化疗在TNBC中的作用机制。
1.材料方法
22例晚期TNBC患者（其中11例接受阿替利珠单抗联合紫杉醇治疗，即联合治疗；11例接受紫杉醇单药化疗）治疗前后的样本，共收集来源于肿瘤活检和血液的78例配对样本，进行sc RNA-seq、sc TCR-seq和sc ATAC-seq。
2.研究思路
3.研究结果
1）共获得489,490个高质量免疫细胞的单细胞转录组数据，其中包括骨髓细胞、先天淋巴细胞（ILCs）、T细胞和B细胞。联合治疗组的B细胞主要在反应性肿瘤中富集，而髓系细胞在无反应性肿瘤中富集。与单独化疗相比，联合治疗的 T 细胞显示出与临床反应的显著相关性，表明阿替利珠单抗可能通过提升 T 细胞功能来促进有效抗肿瘤反应，T细胞可能在PD-L1阻断治疗中起中心作用。基于T 细胞高分辨率图谱，确定了两个高表达PDCD1和CXCL13的T 细胞簇（CD8-CXCL13、CD4-CXCL13），其在 TNBC 肿瘤中扩张，对联合治疗有反应。
2）TNBC肿瘤中的B细胞包括两个主要亚群，CD19+ B细胞和血浆B（pB）细胞。在联合治疗组中，有反应者的CD19+ B细胞水平高于无应答者。且CD19+ B细胞高表达CXCL13（BCA-1）受体基因CXCR5，提示CD19+ B细胞与CXCL13+ T细胞有潜在的联系。比较B细胞在反应性和无反应性肿瘤中的转录差异，发现反应性肿瘤中B细胞高表达基因富集在抗原处理和提呈、对干扰素（IFN）-γ的应答和T细胞激活有关的通路。相反，无反应性肿瘤中的B细胞高表达基因涉及B细胞激活、免疫球蛋白产生和体液免疫反应相关通路。因此，B细胞在抗肿瘤免疫中的作用可能主要归因于激活CXCL13+ T细胞。比较联合治疗和紫杉醇治疗细胞差异，结果表明Bfoc细胞与阿替利珠单抗治疗有相关性，Bfoc和Lti细胞在TNBC肿瘤中协同扩张，对联合治疗有反应。
3）在联合治疗后，有反应患者的树突状细胞（DC）水平高于无反应的患者，这支持了DC在免疫治疗中的作用。比较联合治疗和紫杉醇治疗的细胞差异，发现紫杉醇治疗后成熟 DC（mDC）的降低在同时使用阿替利珠单抗时受到抑制，表明其与PD-L1阻滞相关。功能研究表明 CD4-CXCL13 和 CD8-CXCL13 可能都被 cDC1 或 mDC 激活，从而在联合治疗中起作用。
4）比较治疗后巨噬细胞亚群的动态变化，发现紫杉醇治疗选择性地减少了反应性患者的促炎巨噬细胞Mφ-CCL2和Mφ-MMP9，而增加了免疫抑制的巨噬细胞，表明紫杉醇可能具有免疫抑制作用。
5）利用sc ATAC-seq研究染色质可及性变化，共获得30,758个免疫细胞的数据，通过sc ATAC-seq 和scRNA-seq 综合分析，确定了sc ATAC-seq的免疫细胞亚型。通过比较组合治疗前后的配对 sc ATAC-seq 数据，检查 CD8+、CD8-CXCL13 和 CD4-CXCL13 的染色质可及性的动态变化，染色质可及性动力学揭示的发现与基于转录组的分析结果一致，如两者都支持联合治疗后 CD8-CXCL13 增强的效应特性。
4.研究结论
研究揭示了接受紫杉醇和阿替利珠单抗联合治疗的晚期TNBC患者免疫细胞的动力学特征及与患者反应相关的免疫特征变化，为深入理解 TNBC 患者的免疫特质及免疫治疗联合化疗方案的作用机制提供了可靠基础。
了解肿瘤内细胞类型的复杂性对于解析肿瘤微环境（TME）是至关重要的，TME影响了肿瘤的进展并决定了治疗反应的结果。
研究表明，较高的肿瘤突变负荷（TMB）预示了免疫检查点抑制剂的更好疗效，但目前仅少数结直肠癌（CRC）患者对PD-1抑制剂有反应，其潜在机制尚不完全清楚。该研究结合sc RNA-seq、sc ATAC-seq和WES，在单细胞水平上阐明了异源细胞组成如何决定个体患者的肿瘤微环境，有助于深入了解不同突变负荷状态下的免疫模式。
1.材料方法
选取12例不同癌症分期（I-IV）的CRC患者的癌旁组织、癌前病变组织和肿瘤组织，进行sc RNA-seq、sc ATAC-seq和WES测序。
2.研究思路
3.研究结果
1）sc RNA 共获得 34,037个细胞，鉴定得到 8 个主要细胞类型。sc ATAC 共获得6,525个细胞，鉴定得到 11 个细胞类型。这些细胞类型的组成在不同癌症分期（I-IV）、不同组织部位（癌旁、癌前病变和肿瘤）及TMB水平上表现出显著的异质性。对T细胞和NK细胞重新聚类，sc RNA进一步鉴定得到20 个细胞亚型，sc ATAC 进一步鉴定得到 9个细胞亚型。发现两个调节性T细胞（Tregs）亚型，即CTLA4+Tregs和CTLA4- Tregs，这两个细胞亚型在结肠癌和非小细胞肺癌中也有发现。癌旁组织中以幼稚T细胞（CD8-TCF7和CD4-CCR7）为主，肿瘤中则以耗竭T细胞（CD8-HAVCR2）为主，且耗竭T细胞中TCF7位点的群特异性染色质可及性峰持续减小。
2）对高TMB和低TMB的CRC患者进行单细胞分析，揭示其独特的免疫细胞组成。结果发现高表达CXCL13的Th1/Th17细胞优先在高TMB患者中富集，并对免疫治疗反应良好，表明CTLA4+T细胞可能发挥与微卫星（MSI）不稳定肿瘤中相似的功能，并与检查点阻断的高反应率有关。
3）对髓系细胞进行重新聚类，sc RNA进一步鉴定得到9个细胞亚型，其中包含4个巨噬细胞（Mφ）亚型。发现了混合促炎和抗炎功能的肿瘤相关巨噬细胞（TAM）亚群，其功能不符合M1和M2极化模式，说明TAM比传统的M1和M2分类更具表型和功能多样性。与sc RNA-seq一致的是，sc ATAC发现TAM群中促炎和抗炎基因的启动子都显示出较高的染色质开放性。
4）对B细胞和浆细胞进行重新聚类，鉴定了5个B细胞亚型和5个浆细胞亚型。发现肿瘤组织中驻留记忆B细胞的比例不足，表明B细胞免疫微环境发生了系统性变化。对B细胞免疫功能进行研究，揭示了肿瘤中CD40+和CD27+细胞的抗原提呈作用减弱和抗肿瘤免疫能力减弱。
5）对非免疫细胞进行重新聚类，鉴定得到11个非免疫细胞亚型，其中包含4个成纤维细胞亚型。高表达MHC II 类基因和抗原呈递机制基因而不表达共刺激基因的成纤维细胞亚型，表明该成纤维细胞亚型可能具有向T细胞呈递抗原的能力，但不能支持T细胞的完全激活，从而导致T细胞耐受或无能。利用细胞通讯分析发现与癌旁组织相比，肿瘤中非免疫细胞和免疫细胞的通讯显著扩张，表明非免疫细胞在塑造肿瘤免疫微环境中起着积极的作用。
4.研究结论
该文章整合了sc RNA-seq和sc ATAC-seq 的数据在单细胞水平上阐明了异源细胞组成如何决定个体患者的肿瘤微环境，揭示了免疫细胞和非免疫细胞在塑造肿瘤免疫微环境中的作用。并结合WES数据发现TMB相关的T细胞异质性，有助于不同的免疫模式形成的深入探究。
大多数已报道的耐药机制是通过对Bulk肿瘤标本和/或亚克隆耐药细胞系的分析来确定的。鉴于肿瘤内的异质性是耐药的驱动因素，这种方法可能不能充分揭示其完整的耐药机制。单细胞研究可以描述肿瘤中单个细胞亚群的特征，确定细胞亚群的瘤内异质性，有利于耐药前后细胞类群的变化及耐药机制的探究。
表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）的出现，虽然显著增加了EGFR突变肺腺癌患者一线治疗的无进展生存期（PFS），但是几乎所有服用EGFR-TKIs的患者都会耐药。该研究利用EGFR-TKIs耐药细胞模型和临床标本，进行了sc RNA-seq和sc ATAC-seq，以确定处于完全耐药状态的亲本细胞、耐药持久性（DTP）细胞和肿瘤细胞的转录和表观遗传格局，确定了引起EGFR-TKIs的不同耐药机制以及耐受细胞的状态。
1.材料方法
细胞模型样本：三个EGFR突变的奥西替尼敏感细胞系：H1975细胞（人肺癌细胞），PC9细胞（人肺癌细胞），PC9-ER细胞（人肺腺癌厄洛替尼耐药细胞），及研究者构建的多克隆奥西替尼耐药细胞系：H1975-OR（OR表示对用一线奥西替尼治疗的EGFR突变肿瘤细胞）、PC9-OR、 PC9-EROR细胞（代表在第一代或第二代厄洛替尼治疗失败后用二线奥西替尼治疗的突变肿瘤细胞）；
临床样本：从肝活检（肝转移）样本（Pt-1）、胸腔积液（Pt-2）和经支气管活检样本（Pt-3和Pt-4）中分离的肿瘤细胞。
测序方法：sc RNA-seq+sc ATAC-seq。
2.研究思路
3.研究结果
1）为在单细胞水平检测在奥西替尼暴露期间发生的转录组变化，对亲本细胞及奥西替尼耐药细胞进行sc RNA-seq分析，结果H1975-OR、PC9-OR和PC9-EROR分别获得7,464、7,757和7,787个细胞。t-SNE聚类发现每组亲本或奥西替尼耐药的细胞都表现出不同的基因表达谱。据报道，肿瘤细胞在靶向治疗后保持短暂的DTP状态，允许细胞亚群通过获得遗传或表观遗传改变来适应药物。关注了亲本细胞、DTP细胞和耐药肿瘤细胞的转录组差异，发现不同的细胞系（H1975、PC9、 PC9-ER）显示出不同的转录组模式，且所有细胞系在各个时期均可观察到细胞异质性。结果表明，当细胞获得耐药性时，奥西替尼暴露会诱导显著而复杂的转录组改变，并且这一过程在所建细胞系中是不同的。
2）关注了奥西替尼治疗前后转录组表达变化，H1975-OR（OR30和OR2000）细胞和PC9-OR（OR2000）细胞中检测到相对较高的AURKA表达，而PO9-EROR细胞中，奥西替尼的处理下调了AURKA的表达，表明AURKA不参与对“二线”奥西替尼的抗性机制。此外还发现，TPX2的表达与AURKA的表达重叠。结果表明，AURKA和TPX2高表达的细胞对一线奥西美替尼表现出固有的（H1975）或获得性（PC9-OR）耐药。
3）上皮细胞-间充质转化（EMT）相关基因VIM的表达显示EMT与DTP状态有关，结果表明，PC9-ER细胞获得EMT特征并在奥西替尼治疗期间保持这些特征，该发现与先前的报告一致。sc ATAC-seq的染色体可及性分析发现，与sc RNA-seq表达相一致， H1975-OR30 细胞中VIM启动子区域显示出开放的染色质结构。
4）sc RNA-seq的差异表达基因研究表明，在耐药状态下，奥西替尼诱导CD74表达，且CD74高表达细胞与VIM高表达细胞不重叠，提示CD74独立参与DTP的发生。结果表明CD74可能是奥西替尼耐受状态的潜在诱导剂。根据共表达网络和耐药状态下的基因表达情况，研究者还推测了奥西替尼诱导的CD74表达的作用机制，CD74可能通过诱导抗凋亡蛋白表达（如BCL-XL）来抑制凋亡，从而促进DTP的出现。此外，实验验证结果也表明CD74上调抑制细胞凋亡并导致奥西替尼耐受。
5）最后，研究者对临床样本（Pt-1、Pt-2、Pt-3和Pt-4样品）进行sc RNA-seq的分析研究，分别得到3,763、2,651、747和936个细胞。通过临床样本分析，评估了从细胞系模型获得的结果与临床相关性，总体而言，临床样本中的sc RNA-seq分析验证了细胞系的研究结果。综上，研究表明除了AURKA、VIM和AXL这些已知诱导EGFR-TKIs耐药的基因外，还发现了耐药状态中起关键作用的新基因CD74。
4.研究结论
该文章整合了sc RNA-seq和sc ATAC-seq 的数据在单细胞水平上确定了处于完全耐药状态的亲本细胞、DTP细胞和肿瘤细胞的转录和表观遗传格局，发现了引起EGFR-TKIs的不同耐药机制，为EGFR-TKIs耐药的潜在机制提供了新的见解。
与上期sc RNA-seq和sc ATAC-seq“双C”深度结合的思路不同，本期的文章主要以sc RNA-seq为“C位”，sc ATAC-seq为“辅助”的文章研究思路。可以看出，文章主要以sc RNA-seq为主，构建转录组图谱，发现在不同表型（案例和对照，如癌旁和肿瘤、不同治疗方法、敏感和耐药等）中存在的特异的或有表达差异的细胞类型或基因（如发现肿瘤特异性亚群、对治疗有反应的细胞类型、案例和对照的差异表达基因等），并结合拟时序分析和细胞通讯分析等高级分析，揭示细胞的动态表达变化、分化路径及潜在的作用机制。sc ATAC-seq为辅，仅仅构建染色质可及性图谱，揭示细胞类群的染色质可及性的动态变化，作为转录组分群及基因表达差异（如染色质可及性动力学揭示的发现与基于转录组的分析基因表达的发现一致）的结果的验证。两套数据结合揭示不同表型的基因表达改变、动力学特征改变，挖掘不同表性发挥作用的细胞类型和基因，为机制探究提供可靠依据或基础。
参考文献
1. Zhang Y, Chen H, Mo H, et al. Single-cell analyses reveal key immune cell subsets associated with response to PD-L1 blockade in triple-negative breast cancer[J]. Cancer Cell, 2021, S1535-6108(21)00499-2.
2. Mei Y, Xiao W, Hu H, et al. Single-cell analyses reveal suppressive tumor microenvironment of human colorectal cancer[J]. Clinical and Translational Medicine, 2021, 11(6):e422.
3. Kashima Y, Shibahara D, Suzuki A, et al. Single-Cell Analyses Reveal Diverse Mechanisms of Resistance to EGFR Tyrosine Kinase Inhibitors in Lung Cancer[J]. Cancer Research， 2021, 81(18):4835-4848.