试问近几年生命科学领域最火热的研究方向是什么，那免疫说第二，没人敢说第一。免疫疗法问世之初就得到广泛关注，无论是国家自然科学基金委的资助方向，高校的研究探索，还是诸多药物企业的先驱实验，各大医院的临床实验，全部都将重点聚焦在免疫研究中。免疫治疗不只针对肿瘤本身，而是充分发挥免疫细胞的抗肿瘤活性，为肿瘤治疗开辟出一条新思路。自其问世以来，包括派姆单抗，奥德武纳武单抗等多款PD-1/PD-L1相关免疫治疗药物相继在癌症的治疗领域取得突破性进展。今天小编想要和大家一起探讨的便是免疫分析及其在生物信息学分析中的常用分析方法与研究思路。
1.免疫分析及其意义
肿瘤微环境主要由肿瘤细胞、成纤维细胞、免疫细胞、各种信号分子和细胞外基质及特殊的理化特征等共同组成，肿瘤微环境显著影响着肿瘤的诊断、生存结局以及临床治疗中的药物敏感性。不同免疫浸润细胞的意义因肿瘤组织学而异，某些免疫亚群在某些肿瘤中显示有益的预后作用，而在另一种癌症中则显示出有害影响。另外，不同免疫浸润细胞的作用也不尽相同。比如M1巨噬细胞在各种类型的癌细胞中具有抗肿瘤作用，而M2巨噬细胞则恰恰相反。
癌症免疫治疗已经彻底改变癌症治疗，随着新型免疫治疗药物的开发，免疫浸润评估的重要性也在持续增加。抗CTLA-4、PD-1和PD-L1的抗体对治疗多种恶性肿瘤有效。然而，驱动这些响应的免疫微环境生物学机制尚未被完全理解。最近的研究发现，T淋巴细胞亚群(如CD8+)可以预测对现有和新兴免疫疗法的响应，进一步强调肿瘤相关免疫细胞作为潜在预测生物标志物的重要性。
2.免疫浸润分析的常用方法及其比较
免疫浸润分析是近几年肿瘤研究领域的一个重要方向。目前常用的分析思路大多是基于基因表达谱数据，对肿瘤免疫微环境组分进行分析。主要的计算方法包括对marker gene的ssGSEA富集分析， 基于表达特征对细胞混合物进行反褶积的肿瘤浸润免疫细胞量化方法，基于细胞组分和表达谱的同时反褶积的肿瘤浸润免疫细胞量化方法以及基于NMF非负矩阵分解的肿瘤浸润免疫细胞量化方法等。
图1. 基于转录组学数据定量肿瘤浸润免疫细胞的计算工具的特点
(M=标记基因，P=部分反褶积，C=完全反褶积)
2.1. 基于marker gene的ssGSEA富集分析的免疫分析方法
该方法将不同免疫细胞对应的marker genes作为基因集合, 采用类似GSEA的算法来评估样本中高表达的基因在不同免疫细胞的基因集合中是否富集。其代表性研究工具包括xCell，MCP-counter，ESTIMATE等。
MCP-counter (http://github.com/ebecht/MCPcounter ) 是由Becht团队于2016年开发的一个R包，该R包可以通过归一化后的转录组数据量化异质组织中8个免疫细胞和2个基质细胞的绝对丰度。分数的高低可以显示其在免疫微环境中的浸润程度，细胞之间的丰度不可互相比较。
图2. MCP-counter
MCP-counter的安装与使用：
library(devtools)
install_github("ebecht/MCPcounter",ref="master",subdir ="Source")
library(MCPcounter)
input <- read.table("RNA-seq_data ",sep =" \t",header = TRUE,row.names = 1)
MCPcounter_estimate <- MCPcounter.estimate(input,featuresType = "HUGO_symbols")
#featuresType是确认转录组数据基因名的类型，包括"affy133P2_probesets"，"HUGO_symbols"和"ENTREZ_ID"。
heatmap(as.matrix(ExampleEstimates),col=colorRampPalette(c("blue","white","red"))(100))
另外，基于富集分析对免疫浸润进行分析的常用方法还包括ESTIMATE（https://bioinformatics.mdanderson.org/estimate/index.html），其不能对特异性免疫细胞浸润打分，只能分析免疫细胞，肿瘤细胞纯度和基质细胞的丰度。
图3. ESTIMATE
xCell（http://xcell.ucsf.edu/ ）基于从不同项目和研究的大规模表达数据中提取的489个基因集，对于每种细胞类型，通过反褶积整合基因富集分析对64种细胞类型进行xCell丰度得分评估，包括多个适应性和先天免疫细胞、上皮细胞和细胞外基质细胞等，其中包括48种与肿瘤微环境密切相关的细胞。xCell丰度分数不能直接解释为细胞分数，但它们与真实的细胞比例具有很高的相关性。该方法适用于基因表达谱和传统RNA-seq数据，但不适用于单细胞数据（推荐singleR）。
图4. xCell中的细胞类型
2.2. 基于表达特征对细胞混合物进行反褶积的肿瘤浸润免疫细胞量化方法
卷积和反卷积是深度学习中常见的算法，该方法将每个样本看作是多种免疫细胞的混合，采用线性回归拟合出每种免疫细胞的组分和表达量与最终混合后的关系，通过反卷积算法，提取每种免疫细胞的表达特征。基于表达特征对细胞混合物进行反褶积的方法包括TIMER2，Linear least squares regression，DeconRNASeq，PERT以及CIBERSORT等。其中TIMER2，CIBERSORT都是生物信息学分析中最为常用的免疫浸润分析方法之一。
CIBERSORT（ https://cibersort.stanford.edu/ ）以及其升级版CIBERSORTX（https://cibersortx.stanford.edu/ ）基于表达特征矩阵从来自细胞混合物的表达数据推断22种特定免疫细胞的丰度。与CIBERSORT相比， CIBERSORTx的高明之处不仅在于可以通过单细胞RNA-seq数据构建专属signature（各免疫细胞marker基因），还能够推测各免疫细胞特征基因表达谱，进一步将研究向机制方向伸展。
图5. CIBERSORTX
EPIC（https://gfellerlab.shinyapps.io/EPIC_1-1 ）可根据表达数据分析出8种免疫细胞的浸润比例，包括B细胞、 肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）、CD4+T细胞、 CD8+T细胞、 内皮细胞、 巨噬细胞和NK细胞。EPIC的算法思路是使用约束最小二乘回归将非负性约束条件明确纳入反卷积问题，并强加每个样本中所有细胞分数的总和不超过一。其使用简单，仅需提交RNA-Seq表达数据，设置参数，设置运行任务名称3步即可完成。研究者可以直接在运行结果后分析各种细胞组分在样本中的差异，比如当B细胞、CD8+T细胞、NK细胞比例显著下降时，表明组织中的免疫反应被抑制，免疫细胞的招募过程受到阻碍，肿瘤免疫受到抑制；相反，CAF的增高则与肿瘤的发生发展密切相关。
TIMER2.0 (http://timer.cistrome.org/ ) 是TIMER软件的更新版本，是一个可交互式web工具，能够更全面、灵活的对肿瘤免疫浸润细胞进行分析以及可视化。TIMER2.0版本主要包含Immune, Exploration, Estimate三大模块，可以手动输入RNA-seq的基因TPM标准化值。TIMER2.0综合TIMER, xCell, MCP-counter, CIBERSORT, EPIC和quanTIseq给出120个免疫微环境相关细胞的得分；另外该软件还基于以上六种方法对TCGA数据库中的所有样本进行免疫浸润分析，并提供多个可视化线上工具。
图6. TIMER2.0
2.3. 基于细胞组分和表达谱同时反褶积的肿瘤浸润免疫细胞量化方法
基于细胞组分和表达谱同时反褶积的肿瘤浸润免疫细胞量化方法主要包括DSA和MMAD等。
DSA（https://github.com/zhandong/DSA ）是一种完整的反卷积算法，使用一组从混合组织样本中提取在特定细胞类型中高度表达的标记基因，从而推断复杂组织中的细胞组分和表达谱。
MMAD（http://sourceforge.net/projects/mmad/ ）是一种反卷积算法，当已知细胞比例或特征谱时，既可以执行部分反卷积，也可以基于标记基因进行完全反卷积。
图7. MMAD
除以上分析方法外，还有基于NMF非负矩阵分解的免疫分析方法。该方法类似于突变特征分析，也可以用于从基因表达谱中提取免疫细胞表达谱特征。该策略对应的软件和方法包括 deconf, ssKL , ssFrobenius等。
3. 免疫分析思路以及结果解读
3.1.免疫分析与预后
免疫细胞浸润与癌症患者预后和多种药物响应密切相关，比如这篇于今年8月发表在Front Cell Dev Biol的文章，便是基于CIBERSORT算法中的22种免疫浸润细胞比例将葡萄膜黑色素瘤(UVM)患者分为不同的免疫细胞浸润亚型，识别出不同免疫细胞浸润亚型之间的差异表达基因，对差异表达基因进行无监督聚类以选择最佳基因簇数，分析每个免疫细胞浸润基因簇中免疫检查点相关基因的表达，比较不同分数患者的细胞免疫浸润情况，并进一步基于主成分分析（PCA）计算免疫细胞浸润评分。
图8.流程图
A图中条形图显示TCGA和GEO数据集中基于CIBERSORT算法的22种免疫浸润细胞的比例。B图为22种免疫浸润细胞的相关性矩阵。红色表示不同免疫细胞间丰度呈正相关，蓝色表示负相关。C图表明当k=2时亚型聚类的delta面积显著减少，当k>2时，delta面积进入平台期，所以k=2为最佳聚类系数。E图为聚类结果，D图表明不同免疫浸润亚型的UVM患者预后不同，F图表明不同免疫细胞浸润亚型间肿瘤免疫浸润细胞的比例存在差异。
图9. 葡萄膜黑色素瘤中免疫细胞浸润分布及其亚型特点
3.2.免疫分析与代谢
在肿瘤免疫治疗的过程中，免疫分析从来不是独行者。代谢和免疫是机体生存最基本的需求，在肿瘤细胞拼命与免疫细胞争夺养分能源，努力代谢的同时，其代谢产物也会进一步抑制免疫细胞及其功能。国家自然科学基金委员会生命与医学板块于8月发布 “肿瘤免疫与肿瘤代谢”原创探索计划项目，以更好探索肿瘤代谢与免疫治疗之间的关系。比如这篇于今年7月发表在Advanced Science上，影响因子高达16+的文章，便是对HCC代谢-蛋白之间的互作进行充分分析，并基于代谢-蛋白互作网络中的核心蛋白构建亚型分类器，结合单细胞分析，细胞系分析以及实验分析等多种分析方法，对HCC代谢产物与TME之间关联等代谢与免疫之间的关系进行探究。
在下图的四套HCC数据中都可以观察到，与C2相比，预后不良亚型C1中的代谢通路发生较大范围下调和多个免疫通路的上调 (A)。免疫和代谢之间呈现负相关关系（B, C），且C1亚型表现出更高的免疫相关分数（D）。研究者推测C1缺氧亚型中癌细胞的快速增长可能取决于代谢产物的积累，尤其是不饱和脂肪酸,而不是糖酵解生成的代谢产物。此外，研究者还假设积累的代谢物(F)可能在上调HCC免疫通路中发挥一定作用。
图10. 代谢和免疫调节之间的相互作用
3.3．免疫分析与免疫响应
肿瘤微环境和免疫治疗响应密切相关，单细胞数据的发展为探索肿瘤微环境和免疫治疗之间的关系提供极大帮助。来自NATURE COMMUNICATIONS的一份研究便是基于接受免疫检查点（ICT）治疗黑色素瘤患者的单细胞RNA测序数据集信息，从单细胞水平发现与免疫治疗抵抗相关的免疫细胞亚群，并进一步识别不同免疫细胞亚群的基因表现特征：TREM2高表达的巨噬细胞亚群与ICT耐药有关，并显示独特的基因组特征，包括高表达 SPP1，RNASE1，MT1G，SEPP1，FOLR2，NUPR1等；接着又利用多个公开RNA测序数据集对上述免疫细胞亚群基因表现特征在免疫治疗应答的预测效能进行验证，并借此开发出一个免疫治疗应答预测特征，发现其具有良好的预测效能并优于其他免疫治疗应答特征基因组合。
图11. 黑素瘤中巨噬细胞的亚群与免疫相关基因表达
在今天的分享中，我们主要对免疫浸润分析及其方法，以及一些经典的免疫分析思路进行介绍。同学们在自己的研究中切记不能生搬硬套，要做到活学活用，灵活掌握，在适当的地方添加免疫分析，为自己的文章添光加彩。
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