01 内容
肿瘤微环境是指肿瘤的发生、生长及转移与肿瘤细胞所处的内外环境有着密切关系，它不仅包括肿瘤所在组织的结构、功能和代谢，而且亦与肿瘤细胞自身的(核和胞质)内在环境有关。肿瘤与环境，两者既是相互依存，相互促进，又是相互拮抗，相互斗争的。它是现代肿瘤生物学的一个关键和核心的问题。近年来由于肿瘤细胞学和分子生物学的进展，人们对于肿瘤和环境的相互关系有了更加深入的了解。这不仅对于认识肿瘤的发生、发展、转移等有着重要的意义，而且对于肿瘤的诊断、防治和预后亦有着重要的作用。今天为大家带来一篇2020年发表于JEM（The Journal of Experimental Medicine）的文章：Accumulation of long-chain fatty acids in the tumor microenvironment drives dysfunction in intrapancreatic CD8+ T cells，探讨代谢物对于研究肿瘤微环境的意义。
02 文章速读
CD8+ T细胞是抗肿瘤免疫的主效应因子，它们在肿瘤部位的存在与良好的结果相关。然而，肿瘤微环境(TME)所施加的代谢约束会抑制它们控制肿瘤进展的能力。文章描述了在胰腺导管腺癌(PDA)的TME区脂质聚集，CD8+ T细胞浸润小鼠和人类肿瘤。在这种富含脂质但缺乏营养的TME中，利用脂质代谢对维持细胞功能尤为重要。
本研究发现，胰腺内CD8+ T细胞逐渐积累特定的长链脂肪酸(LCFAs)，而不是提供燃料来源，这损害了它们的线粒体功能，并触发脂质代谢途径的主要转录重编程，从而导致脂肪酸分解代谢的减少。特别是，胰腺内CD8+ T细胞特异性地表现出极长链酰辅酶A脱氢酶(VLCAD)的下调，这加剧了介导脂肪毒性的极长链脂肪酸(VLCFAs)和极长链脂肪酸(VLCFAs)的积累。通过ACADVL的强制表达，肿瘤特异性T细胞的代谢重编程能够增强肿瘤内T细胞的存活和持久性，克服了PDA免疫治疗的一个主要障碍。
03 文章背景
1.胰管腺癌（PDA）患者的总体生存率似乎与CD8+T细胞浸润有关，但我们对调节这些浸润T细胞在肿瘤微环境(TME)背景下功能的机制的认识仍然有限。
2.CD8+T细胞是抗肿瘤免疫的关键效应因子。然而，肿瘤浸润的CD8+T细胞往往获得被称为“衰竭”的分化状态的改变，因此无法控制肿瘤的生长。在PDA患者和PDA的小鼠模型中的几项研究表明，CD8T细胞往往很少，如果存在，则会变得功能失调。
3.最近的发现表明CD8+T细胞的激活和分化与代谢重编程密切相关。恢复CD8+T细胞依赖氧化磷酸化(OXPHOS)来促进其代谢需求。
4.肿瘤细胞具有高度的糖酵解，并通过消耗大量关键营养物质，特别是葡萄糖来支持其过度生长，这也是最佳T细胞激活所必需的。当缺乏葡萄糖时，CD8+T细胞产生效应细胞因子的能力受到损害。然而，它们仍然可以通过线粒体OXPHOS维持其增殖和效应功能，使用长链脂肪酸(LCFAs)通过脂肪酸(FA)β氧化过程来促进三羧酸循环。
5.目前尚不清楚肿瘤微环境（TME）的营养成分变化如何与观察到的肿瘤浸润CD8+T细胞功能障碍相关。
6.现有数据表明，肿瘤特异性CD8+T细胞的代谢重编程可能是促进代谢敌对TME存活的策略，作为提高免疫治疗临床疗效的方法的一部分。
04 方法技术
1.免疫组化
2.免疫荧光
3.T细胞分离
4.透射电镜
5.油红O脂质染色
6.葡萄糖浓度测定
7.细胞外通量分析
8.流式细胞分选
9.小鼠静脉给药
10.T细胞脂质组学分析液相色谱
11.细胞转录组分析
12.质谱成像
13.小鼠T细胞TCR转导
14.过继性免疫疗法
15.超声成像
16.单细胞测序
实验结果
1.胰腺TME在PDA进展过程中积累脂质
（1）脂质在PDA TME中积累，而葡萄糖和H6Ps在PDA进展过程中减少
在9 - 30周的不同时间点处死小鼠，根据细胞学和结构异常，将肿瘤发展分为早期胰腺上皮内瘤变和高级别瘤前病变。中性脂质从早期到晚期的发展过程中在胰腺组织中积累。通过k-means聚类对数据进行分割，并将IMS与共聚焦图像进行共配，得到一个平均谱，并与连续切片上的CD8+ T细胞分布呈正相关。
（2）中性脂质和LC甘油磷脂在PDA进展过程中积累在TME中
在CD8T细胞填充的区域（其中一个以橙色突出显示）的进展过程中发现一个具有代表性的脂质物种PE（42：6）(一种多不饱和磷脂酰乙醇胺，总碳FA链长度为42个碳)富集。研究表明，在浸润CD8+T细胞的地区，含有非常长链FAs(VLCFAs)的特定甘油磷脂在胰腺上皮内瘤变中富集。结果主要检测到PEs和磷脂酰肌醇的增加，特定物种的富集在早期病变中已经明显。磷脂酰丝氨酸和磷脂酰胆碱的差异不太明显。与对照相比，非常长链(VLC)鞘磷脂在晚期疾病时间点相对减少。
2.CD8+T细胞在PDA进展过程中功能受损
用免疫组织化学方法对T细胞在原位的浸润进行了纵向分析，发现这两个CD4+和CD8+T细胞在疾病早期渗透到胰腺，并持续到后期。浸润胰腺组织的免疫细胞的流式细胞术分析表明，总CD3+T细胞的百分比在炎症早期达到峰值，并在高级别病变中保持相似的频率。根据先前的研究，在CD3T细胞中，Foxp3调节性T细胞的绝对数量和CD4T细胞总数的百分比增加。相反，两个绝对数和频率随着时间的推移，CD8+T细胞明显下降，而它们逐渐获得功能衰竭的特征，这是由耗竭标记的上调所表明的，包括PD1和TIM3和降低产生效应细胞因子和分子的能力，如IFNγ和颗粒酶β。因此，PDA能够招募初始CD8+T细胞免疫反应，但CD8+T细胞在肿瘤进展过程中功能受损。
3.胰腺内CD8+T细胞积累VLCFAs，CD8+T细胞功能障碍与特定LCFAs的积累有关
（1）胰腺内CD8+T细胞积累VLCFAs
早期和晚期胰腺上皮内瘤变浸润CD8+T细胞明显高于对照脾。对CD8+T细胞脂质表达谱表明，在早期时间点，浸润的CD8+T细胞的脂质组成已经与幼稚细胞显著不同。比较CD8+和CD4+T细胞浸润晚期胰腺上皮内瘤变的脂质组成谱，观察到除甘油磷脂外，所有超级水平的脂质的总体增加，它们是细胞膜的主要结构成分。在晚期时间点发现不同的FAs富集。在从晚期胰腺上皮内瘤变分离的CD8+T细胞中积累的FAs列表中发现棕榈酰胺，在BSA-棕榈酸存在下培养CD8+T细胞，发现棕榈减少增殖和分泌效应分子的能力，如IFNγ、颗粒酶β和TNF-α。
（2）VLCFA在胰腺内CD8T细胞积累
荧光葡萄糖类似物2-[N-(7-硝基苯-2-oxa-1，3-二唑-4-yl)氨基]-2-脱氧-D-葡萄糖(2-NBDG)的摄取在CD8+T细胞亚群中具有可比性。从早期和晚期，胰腺上皮内瘤在其膜上表达CD36，与通过浸润CD8T细胞增加LC脂质摄取一致的。观察到在CD4+T细胞和总CD45+CD3-髓系细胞中，Bodipy-C16的摄取也高于脾细胞，提示了一种免疫细胞浸润胰腺TME的一般机制，通过试图从葡萄糖转化为脂质代谢来适应其独特的营养成分。脾幼稚T细胞和浸润CD8+T细胞的早期和晚期胰腺上皮内瘤变具有不同的代谢谱。与早期相比，浸润晚期胰腺上皮内瘤变的CD8+T细胞表现出更明显的组成变化。特别是，在疾病进展的时间过程中，对统计上不同的脂质代谢化合物的注释证实了浸润的CD8+T细胞中脂质的总体增加，这在晚期胰腺上皮内瘤变中更明显地表现在FAs的超类水平上。共享相同TME的浸润CD4+T细胞在早期和晚期胰腺上皮内瘤变中表现出最小的差异，与CD8+T细胞不同，CD4+T细胞在肿瘤进展过程中没有经历主要的脂质积累。检测CD8+T细胞在肿瘤进展过程中在体内形成LDs的能力，结果发现即使>20%浸润早期病变的CD8+T细胞中含有LD，但在晚期时间点，这一显著降低。
4.胰内CD8+T细胞在富含脂质的PDA TME中代谢耗尽
通过观察棕榈酸对其线粒体功能的影响，发现棕榈酸处理的CD8+T细胞显示线粒体功能下降。相反，亚油酸治疗不会引起任何线粒体功能障碍。浸润晚期胰腺上皮内瘤变的CD8+T细胞表现出较高的线粒体频率，有不规则的嵴和扩张的腕间间隙（肿胀），以及具有明显电子致密基质的高凝结线粒体，通常存在于凋亡前细胞中，且线粒体质量下降。在积累BodipyFLC16的CD8+T细胞中，线粒体染色仅在棕榈处理后显著降低，CD8+T细胞积累中性脂质(脂质TOX)即使在棕榈处理时也没有表现出类似的线粒体缺陷。FACS分析显示，与CD4室相比，CD8室的Bodipy FL C16阳性细胞和MitoTracker阴性细胞的频率明显升高。结果表明，虽然大多数CD4+T细胞能耐受LC脂质的摄取，但吸收LC脂质的CD8+T细胞中有很大一部分具有受损的线粒体。在比较CD8+T细胞与髓系细胞室(CD45+CD3−时)，也得到了类似的结果,提示脂质积累和线粒体功能障碍可在浸润的CD8T细胞中特异性地交织在一起。与幼稚T细胞相比，CD3/CD28结扎激活后OCR显著增加，但优先使用有氧糖酵解。相反，OXPHOS对早期浸润CD8和CD4T细胞至关重要，可能是一种满足在肿瘤内发挥其功能所必需的高代谢需求的手段。然而，CD8+T细胞逐渐失去了参与OXPHOS的能力，在晚期时间点与早期胰腺上皮内瘤变细胞相比。相反，浸润的CD4+T细胞在肿瘤进展过程中增加了OCR率。
5.浸润晚期腺上皮内瘤变的CD8+T细胞显示ACADVL下调
（1）胰腺内CD8+T细胞从早期和晚期病变是转录不同的
RNA测序突出了与早期和晚期腺上皮内瘤变相关的不同特征。差异调节基因在不同的T细胞群体中表现出改变的代谢特征，包括与FA稳态相关的基因亚群。与静息的幼稚T细胞相比，活化的CD8+T细胞对检测基因的很大一部分(n=58)有差异调节作用。然而，Palm存在下的激活大大改变了它们的转录谱，特别是参与FA代谢的基因。ACADVL在LCFA处理的细胞中与对照相比明显下调，证实其表达与LCFA积累密切相关。
（2）浸润晚期腺上皮内瘤变的CD8+T细胞ACADVL缺乏
从晚期腺上皮内瘤变中分离到的浸润的CD8+T细胞与从早期腺上皮内瘤变中分离出来的CD8+T细胞转录不同，晚期病变分离的细胞表现为参与细胞介导的细胞毒性和线粒体功能(Ndufa3、Ndufa9、Ndufa11和Vdac3)的关键基因下调。分析证实，CD8+T细胞在浸润晚期腺上皮内瘤变时，VLC酰辅酶A脱氢酶(VLCAD)水平低于早期。相反，在相同的富含脂质的TME中，CD4+T细胞上调了VLCAD的水平，与它们接触OXPHOS和适应不断变化的TME的能力相一致。
6.肿瘤特异性T细胞工程表达更高水平的ACADVL表现出增强的代谢适应能力
（1）用于表达ACADVL的肿瘤特异性T细胞具有更好的代谢适应能力
用一个含有TCR1045单独或TCR1045和ACADVL的结构转导CD8+T细胞，该结构由P2A元件连接。与TCR1045单独相比，ACADVL在Msln特异性T细胞中的过表达导致ACADVL-TCR1045转导的细胞酶活性升高，过表达ACADVL的T细胞线粒体功能较高。ACADVL-TCR1045细胞基底OCR和备用呼吸能力升高。监测KPC小鼠，直到发育一个定义的胰腺肿瘤肿块，然后再进行相同数量的TCR1045和ACADVL-TCR1045T细胞，表达不同的同源标记，以方便跟踪每一个群体的工程T细胞随时间在同一个治疗宿主在同一个TME。结果发现，在输注后10d，ACADVL-TCR1045T细胞在肿瘤中的数量明显高于TCR1045T细胞，表现出较好的T细胞代谢适应度和生存优势。在输注后21d，ACADVL-TCR1045T细胞的这种优先存活更加明显，表明表达ACADVL的T细胞在代谢敌对的TME中提高了存活和持久性。
（2）ACADVL过表达增强了代谢适应能力
转导的T细胞表达工程TCR(Vβ9)和结合的H2-Db四聚体，即MHCI等位基因，含有Msln406-414。体外刺激和转导7d后，两种细胞类型均表达类似的激活标记CD69和4-1BB，并产生类似数量的抗肿瘤细胞因子IFNγ和TNFα，以响应刺激同源MSln406-414肽。在输注后21d，ACADVL-TCR1045T细胞的这种优先存活更加明显，表明表达ACADVL的T细胞在代谢敌对的TME中提高了存活和持久性。相对于TCR1045T细胞，在脾脏和血液中也发现了更多的ACADVL-TCR1045T细胞。注射后10d，ACADVL-TCR1045T细胞仅表达低水平的PD-1、Tim-3、Lag-3和TIGIT，与报道的TCR1045T细胞相似。在转移后10d从肿瘤中分离出的两个T细胞群体与脾对应物相比，减少产生IFNγ和TNFα，但相互之间的细胞因子数量相似。
7.人胰腺内CD8+T细胞下调人脂质丰富的TME中ACADVL
（1）人CD8+T细胞浸润PDA的脂质积累和ACADVL功能障碍
评估七对匹配的人类PDA和邻近的正常组织，红油O染色证实了人PDA肿瘤积累中性脂质的趋势。与小鼠样本一样，人样本中VLC鞘磷脂相对减少。转录类似于先前描述的耗尽的T细胞，CD8+T细胞浸润PDA显示ACADVL表达减少。
（2）人CD8+T细胞浸润PDA的脂质积累和ACADVL功能障碍
与小鼠模型相似，我们发现LC甘油磷脂积累在七个人类PDA样本中的五个，这种积累对于PE和PI是最明显的。在12个人类PDA肿瘤和9个匹配的邻近正常胰腺组织上的单细胞RNA-seq证实，浸润这两个不同胰腺微环境的CD8T细胞转录不同，人类PDA浸润的CD8T细胞降低了与细胞毒性特征相关的基因的表达。用特异性荧光共轭抗体对22例慢性胰腺炎和96例PDA肿瘤进行多光谱图像分析，在蛋白质水平上证实ACADVL在肿瘤浸润CD8T细胞中的特异性下调。
思路总结
1.质谱成像检测到在胰腺上皮内瘤变（PDA）从早期到晚期的肿瘤微环境（TME）中脂质积累；
2.免疫组化和流式分析CD8+T细胞在PDA进展过程中功能受损；
3.相对定量分析及主成分分析胰腺内CD8+T细胞积累非常长链脂肪酸（VLCFAs），CD8+T细胞功能障碍与特定长链脂肪酸（LCFAs）的积累有关；
4.透射电镜及流式分析胰内CD8+T细胞在富含脂质的PDA TME中代谢耗尽；
5.高通量测序及免疫荧光分析浸润晚期腺上皮内瘤变的CD8+T细胞显示酰-CoA脱氢酶（ACADVL）下调；
6.用一个含有TCR1045单独或TCR1045和ACADVL的结构转导CD8+T细胞，注射小鼠，检测T细胞存活率及细胞因子分泌情况，肿瘤特异性T细胞工程表达更高水平的ACADVL表现出增强的代谢适应能力；
7.组织脂质染色、高通量测序、质谱成像、免疫荧光检测人胰腺内TME中CD8+T细胞ACADVL下调。
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