菜鸟学习之旅(一)——无缝克隆(中)

上一部分中介绍了最最基础的PCR反应和传统分子克隆，包括内切酶，连接酶，外切酶，PCR扩增，转化等等是之后所有分子克隆的基础。如果说限制性内切酶克隆是入门级的话，那平端克隆和TA克隆就是初级水平。

PCR克隆

PCR克隆是将目的基因经过PCR扩增后直接连接在载体上的克隆技术，相对于传统分子克隆，PCR克隆有着其独特的优势，不需要特意寻找合适的酶切酶；不需要使得目的基因和载体之间兼容匹配；需要较少的DNA等。但是PCR克隆需要注意PCR 引物和扩增条件、所选克隆方法和使用的克隆载体。PCR最简单的两种克隆方式平末端克隆和TA克隆。

平末端克隆

    将缺少突出端的插入片段连接到同样没有突出端线性载体中，使用具有 3’→5’ 核酸外切酶或具有校对活性的高保真 DNA 聚合酶能够获得平端插入片段(平滑端修饰)。它们的校正活性能够提高扩增产物的序列准确性；但是，最大的问题就是插入到平端克隆载体时的连接效率较低以及无法定向克隆。

TA克隆

TA克隆适用于可扩增短DNA序列的热稳定TaqDNA聚合酶。该酶缺乏 3’→5’ 校对活性，并具有可在扩增子 3’ 末端（3’dA）额外添加脱氧腺嘌呤的末端转移酶活性。得到的具有 3′ dA 突出端的 PCR 产物连接到含有突出互补 3’ 脱氧胸腺嘧啶（3’dT）突出端的线性TA 克隆载体中。dA的添加可用于常规PCR反应添加，也可以是平末端添加dA，取决于你的目的片段和所采用的试盒。比如Takara的Mighty TA-cloning Kit 中是在3'端获得一个dA碱基；Mighty TA-cloning Reagent Set for PrimeSTAR®中DNA聚合酶具有很强的3'-5'外切酶活性，会导致平末端需要去额外添加A碱基。

优点：不需要引物和特定的酶切位点序列，简单方便；

缺点：加大酶切位置的判断难度，过长的片段会导致克隆效率的降低。

TA克隆和平末端克隆

TA克隆 常见T载体

    二十年前，TOPO 之名就已成为 PCR 克隆领域高质量和颠覆性创新的代名词。如今，TOPO 克隆试剂盒仍然是最快捷、最简单、最高效的克隆解决方案。TOPO克隆技术就是很好的将上述所讲技术的结合。如下图所示，TOPO流程更加的方便，快捷，高效。

    TOPO克隆载体的核心在于DNA拓扑异构酶I，该酶同时具有限制酶和连接酶特性，拓扑异构酶I可特异性地识别五核苷酸序列5’-(C/T)CCTT-3’，并且可与连接到3´胸腺嘧啶脱氧核苷的磷酸基团形成共价键。TOPO克隆类型根据PCR产物和相对应的克隆载体末端有密切关系。主要分为TOPO TA Cloning；利用Zero Blunt TOPO克隆方法克隆平末端DNA；利用定向TOPO克隆方法克隆平末端DNA。

TOPO克隆流程

随着技术的不断进步和对效率的需求越来越旺盛，无缝克隆逐渐走进了大家的视野，相比之下，无缝克隆操作更加简单，灵活性更强，同时几乎不受序列的限制，一次可定向组装高达10个片段的dsDNA。接下来就是我们的重点：无缝克隆。

    无缝克隆相比较之前所讲的限制性内切酶克隆和PCR克隆，其不会在年末端或者平末端形成一道"裂缝"，所以称之为无缝克隆。在这一部分，我们主要讲一下无缝克隆基础以及所分的流派和现在市面上有的产品；所依赖的简单原理，为后面的应用提供一个基础。

无缝克隆分类

    现在主流的两种无缝克隆是Gibson assembly和Golden Gate assembly。因为Gibson assembly厂商多，方法流程化，应用广泛所以现在主讲Gibson assembly，如果有后续需要，再学习Gate。与传统的双酶切克隆一般，无缝克隆同样需要目的片段的插入并依赖于dsDNA的黏性末端进行互补配对，并利用DNA连接酶催化形成磷酸二酯键修复缺口。它本质上和之前介绍的PCR克隆是一样的，但是需要目的片段连接端通过PCR方法连接15-20bp载体连接位点的同源序列，然后将DNA片段和载体混合并加入Master Mix进行连接，从而完成“无缝”克隆。

无缝克隆大致流程

*综上我们发现最重要的部分就是Master Mix

一种外切酶，而不是之前的内切酶。从5’端开始对DNA进行消化，产生长的黏性末端，这样才能与另外的同源末端进行配对结合。因为是从5'端开始切除碱基，所以引物设计就非常关键了。特异性引物设计部分还是遵循着上一部分所讲的原则，而同源序列的设计可以按照下图所示原则进行设计。

同源序列引物设计

聚合酶负责碱基连接；连接酶负责DNA片段的连接。有意思的是，5'外切酶最适合温度是37℃，连接酶和聚合酶反应温度为50℃，三个酶在一个体系内，温度的控制使得DNA不会被剪切为ssDNA，同源序列引物序列>15bp，使得反应顺利进行。

Gibson Assembly最大的优势就是能够不受片段序列的限制、实现任意组装。因为是靠同源重组进行连接，所以没有必要去考虑限制性内切酶是否会切断目的片段；同时无缝地拼接多个片段，传统的酶切克隆，由于酶切位点有限能组装的片段数量是有限的。同时，由于酶切位点之间存在着一定的空间距离，片段与片段之间不可避免地会产生间隔；能够节省时间。

    这部分我们简单介绍了PCR克隆基础技术和无缝克隆的基础原理，分类以及优势。后面将具体介绍无缝克隆的流程，引物设计工具以及Snapgene的应用方式。