Counts FPKM RPKM TPM CPM 的转化

一、什么是RPKM、 FPKM、TPM、CPM

RPKM, FPKM and TPM, clearly explained - StatQuest!!!
对基因counts进行校正定量一般有RPKM、FPKM 、TPM和CPM这几种方法，StatQuest网站中对RPKM, FPKM 和 TPM作了通俗简要的说明，现将其核心要点整理如下：

RPKM

RPKM (Reads Per Kilobase Million, or Reads Per Kilobase of transcript per Million reads mapped)
每千个碱基的转录每百万映射读取的reads

计算RPKM的方法：

1. 计算样本中的总reads，并将该数字除以1,000,000——这是我们的“每百万”缩放因子 ( “per million” scaling factor ) 。
2. 将reads数除以“每百万”缩放因子。消除测序深度影响，得到每百万reads（RPM, reads per million ）
3. 将RPM值除以基因长度（以千碱基为单位），消除基因长度影响，得到RPKM。

FPKM

FPKM (Fragments Per Kilobase Million, or Fragments Per Kilobase of transcript per Million reads mapped)
每千个碱基的转录每百万映射读取的fragments

FPKM与RPKM非常相似。RPKM是针对单端测序的RNA-seq而言的，其中每个reads对应于一个已测序的单个片段。FPKM用于双端测序的RNA-seq。使用双端测序RNA-seq，两个reads可以对应一个片段（Fragment）。RPKM和FPKM之间的唯一区别是FPKM考虑到两次reads可以映射到一个片段（因此它不会对该片段进行两次计数）。
即 单端测序：reads=fragments，双端测序：2 * reads≈fragments
而经过上游处理，双端测序两个reads可以对应一个片段的过程已经完成，最后得到的counts就已经相当于是片段fragments了，因此下游分析由counts计算RPKM、 FPKM这两者的公式完全一致。

TPM

TPM (Transcripts Per Million, or Transcripts Per kilobase of exon model per Million mapped reads)
每千个碱基的转录每百万映射读取的Transcripts

计算TPM的方法：

1. 将读数计数除以每个基因的长度（以千碱基为单位），得到每千碱基reads（RPK, reads per kilobase）。
2. 计算样本中所有RPK值，然后将其除以1,000,000，得到“每百万”缩放因子 ( “per million” scaling factor )。
3. 将RPK值除以“每百万”缩放因子，得到TPM。

因此在计算TPM时，与RPKM、 FPKM相比，唯一的区别是TPM先对基因长度进行标准化，然后对测序深度进行标准化。但是，这种差异的影响非常深远。因为使用TPM时，每个样本中所有TPM的总和是相同的，这样可以更轻松地比较每个样本中映射到基因的读数的比例。相反，使用RPKM和FPKM，每个样本中的标准化读数之和可能会有所不同，这使得直接比较样本变得更加困难。

CPM

CPM（Counts Per Million, or Counts of exon model Per Million mapped reads） 每百万映射读取的counts

除了RPKM、 FPKM、TPM这几种方法，CPM也是较为常见的一种基因定量方式。原始的表达量除以该样本表达量的总和，再乘以一百万，即可得到CPM值。CPM值只对测序深度进行了标准化，一般利用edgeR包的cpm()函数即可对基因counts进行简单校正 。
edgeR::cpm(counts)

二、由Counts计算FPKM/RPKM和TPM

有许多文章已经给出了这几种计数方式的计算和转化关系，如What the FPKM? A review of RNA-Seq expression units | The farrago (wordpress.com)。

countToTpm <- function(counts, effLen)
{
rate <- log(counts) - log(effLen)
denom <- log(sum(exp(rate)))
exp(rate - denom + log(1e6))
}

countToFpkm <- function(counts, effLen)
{
N <- sum(counts)
exp( log(counts) + log(1e9) - log(effLen) - log(N) )
}

fpkmToTpm <- function(fpkm)
{
exp(log(fpkm) - log(sum(fpkm)) + log(1e6))
}

countToEffCounts <- function(counts, len, effLen)
{
counts * (len / effLen)
}

################################################################################
# An example
################################################################################
cnts <- c(4250, 3300, 200, 1750, 50, 0)
lens <- c(900, 1020, 2000, 770, 3000, 1777)
countDf <- data.frame(count = cnts, length = lens)

# assume a mean(FLD) = 203.7
countDf$effLength <- countDf$length - 203.7 + 1
countDf$tpm <- with(countDf, countToTpm(count, effLength))
countDf$fpkm <- with(countDf, countToFpkm(count, effLength))
with(countDf, all.equal(tpm, fpkmToTpm(fpkm)))
countDf$effCounts <- with(countDf, countToEffCounts(count, length, effLength)) 

为了更清楚直观地明白FPKM/RPKM和TPM的计算过程，根据StatQuest定义给出的计算方法，自已重新写了由counts转化为FPKM/RPKM和TPM的计算公式代码，经过验证其结果与上面公式所得结果一致，那今后就用自己写的这些代码吧，具体代码如下：

#TPM (Transcripts Per Kilobase Million)  每千个碱基的转录每百万映射读取的Transcripts
counts2TPM <- function(count=count, efflength=efflen){
  RPK <- count/(efflength/1000)   #每千碱基reads (reads per kilobase) 长度标准化
  PMSC_rpk <- sum(RPK)/1e6        #RPK的每百万缩放因子 (“per million” scaling factor ) 深度标准化
  RPK/PMSC_rpk                    
  }                   

#FPKM/RPKM (Fragments/Reads Per Kilobase Million )  每千个碱基的转录每百万映射读取的Fragments/reads
#RPKM与FPKM分别针对单端与双端测序而言，计算公式是一样的
counts2FPKM <- function(count=count, efflength=efflen){ 
  PMSC_counts <- sum(count)/1e6   #counts的每百万缩放因子 (“per million” scaling factor) 深度标准化
  FPM <- count/PMSC_counts        #每百万reads/Fragments (Reads/Fragments Per Million) 长度标准化
  FPM/(efflength/1000)                                    
  }

#FPKM与TPM的转化
FPKM2TPM <- function(fpkm){
  fpkm/sum(fpkm)*1e6
  }


tpm <- as.data.frame(apply(counts,2,counts2TPM))
colSums(tpm)

fpkm <- as.data.frame(apply(counts,2,counts2FPKM))
colSums(fpkm)

tpm0 <- as.data.frame(apply(counts,2,FPKM2TPM))
colSums(tpm0)

要注意一点的是计算FPKM/RPKM和TPM时，基因长度一般指的都是基因的有效长度effective length，即该基因的外显子总长度或转录本总长度，以此为标准来消除测序造成的基因长度影响才更为准确。可参见生信技能树文章：基因长度之多少 | 生信菜鸟团 (bio-info-trainee.com)
关于如何得到基因有效长度，请参阅文章：获取基因有效长度的N种方法。

参考资料：
RPKM, FPKM and TPM, clearly explained - StatQuest!!!
What the FPKM? A review of RNA-Seq expression units | The farrago (wordpress.com)
RPKM、FPKM、TPM详解
RNA-seq的counts值，RPM, RPKM, FPKM, TPM 的异同 - 云+社区 - 腾讯云 (tencent.com)