文献学习045--[sc+Organoids]IPSC-来源的心脏类器官和单细胞测序探究免疫抑制剂对人类心脏的作用

今年四月份发表在circulation上的一篇LETTER，作者是斯坦福大学的Joseph C. Wu教授。

心脏移植是终末期心衰患者治疗的基石。由于免疫抑制策略的发展和患者长期合并症的改善，移植后生存率获得了巨大提升。 尽管如此，中位移植物存活期仍为12.5 年，原发性移植物功能障碍是导致死亡的主要原因，占心脏移植人群死亡人数的 22%。尽管排斥反应、同种异体移植心脏血管病变和各种供体特征都与移植心脏的功能障碍有关，免疫抑制剂如钙调神经磷酸酶抑制剂（tacrolimus他克莫司）和增殖信号抑制剂（sirolimus西罗莫司，也就是雷帕霉素）对长期移植物功能的潜在心血管不良影响仍然不明确。
在这个研究中，作者在比较了与每种药物相关的临床表型后，使用人类诱导的多能干细胞衍生的心脏类器官模型检测了他克莫司和西罗莫司的心血管作用。

A：作者首先通过连续超声心动图检测评估了移植后 6 至 30 个月左室 (LV) 质量的变化来评估心脏移植物的重塑。作者根据心脏移植时使用的免疫抑制剂Tacrolimus/Sirolimus对患者进行分组。结果显示和Tacrolimus组相比，Sirolimus组存在明显的左室质量减低 (reduction of 19.91 g, 95% CI reduction of 25.6 g to 7.85 g)。LV 质量增加是不良重塑的一个特征，可能导致舒张功能障碍和心脏移植物功能障碍。这个结果与此前一项研究观察到与钙调神经磷酸酶抑制剂相比，增殖信号抑制剂具有良好的心脏重塑特征相一致¹。

B：为了阐明导致 LV 质量变化的机制，作者使用了人类心脏类器官。它们是由诱导多能干细胞衍生的心肌细胞、成纤维细胞和内皮细胞的组成的球型心脏多细胞簇 (CMC)。 作者使用他克莫司、西罗莫司或载体处理 CMC，并进行功能表型分析。

CMC只包含心肌、内皮、成纤维吗？

C：作者没有观察到药物治疗组相比control组出现明显的细胞死亡和活性氧反应（结果未展示）。结果还显示，在药物治疗5d后，CMCs没有出现明显的收缩和舒张速度的差异，和临床上没有发现这些药物可以引起收缩和舒张功能的快速改变相一致。
D：为了进一步探究免疫抑制剂治疗下的细胞类型特异性反应，以解释临床上的生理差异，作者对CMCs进行了单细胞测序。得到了不同治疗条件下的心肌、内皮、成纤维3类细胞。

E：tacrolimus治疗组，CMC中的成纤维细胞展现出高表达胶原产生、细胞黏附、细胞外基质形成的基因如SERPINH1, P4HB, PLOD1, COL21A1和P3H4。
F：作者还观察到，和sirolimus组相比，tacrolimus治疗组的心肌细胞和成纤维细胞都高表达BNIP3。既往有研究显示BNIP3与缺血后模型中心脏促纤维化反应和心脏不良重塑有关。这些结果显示tacrolimus可能与细胞外基质沉积和adverse remodeling有关。
而在Sirolimus治疗组的心脏成纤维细胞中则没有观察到这种现象，而且心肌细胞出现高表达心肌细胞marker如NPPA和TNNI1。在内皮细胞中也没有观察到上述基因变化。

G：为了验证检测到的基因表达变化是否与更促纤维化表型一致，作者检查了sirolimus和tacrolimus对iPSC衍生的心脏成纤维细胞的影响，发现与对照组或tacrolimus相比，sirolimus与显着降低的细胞增殖有关。此外作者观察到与sirolimus和对照组或相比，tacrolimus组出现明显的胶原产生增加。这提示和tacrolimus相比，sirolimus与更少的促胶原形成及促纤维化表型相关，提示它(至少部分)更少的驱动了成纤维细胞增殖。
H：剂量滴定实验提示与前述一致的效应在tacrolimus 10 nmol/L和sirolimus 10 nmol/L的低剂量下就可以发生。

Summary
该研究结果表明，与tacrolimus相比，sirolimus与 CMC 中较少的纤维化表型相关。 增加的纤维化和细胞外基质沉积是在出现了LV 质量增加和心脏移植物功能障碍相关的多种心肌病的特征。 该结果表明，不同的心脏成纤维细胞调节可能导致心脏移植物功能障碍的不良重塑特征。 这些发现可以解释增殖信号抑制剂（西罗莫司）对本研究和其他相关研究中观察到的不良重塑的长期益处。
此外，钙调神经磷酸酶抑制剂（tacrolimus）可能与心脏组织中的促纤维化表型趋势相关，这可能导致不利的心脏重塑。 总之，将iPSC衍生的心脏类器官与单细胞 RNA 测序相结合，可以为未来的研究提供一个平台，以发现更有针对性的方法来改善tacrolimus相关的心脏重塑并复制有利的sirolimus心脏特征。

References:
Paoletti E. mTOR inhibition and cardiovascular diseases: cardiac hypertro- phy. Transplantation. 2018;102(2S suppl 1):S41–S43. doi: 10.1097/TP. 0000000000001691

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在2014年的时候Joseph C. Wu教授还发表过这样一篇CR

1. Expression of Cardiomyocyte Markers and CAR in hiPSC-CMs

Fig 1A：study design
Fig 1B：诱导出来的hiPSC-CMs表达心脏特异性的肌小节蛋白cTnT和a-Actin。
Fig 1C：hiPSC-CMs的cell–cell junctions有CAR的表达。（Nuclear stain for CAR in CMs has been previously reported and may repre- sent antibody cross-reactivity with a nuclear antigen.）
CAR在hiPSCs中也表达，提示hiPSCs和hiPSC-CMs都可以被CVB3感染（附件）。
Fig 1D：作者使用qpcr检测了hiPSC向hiPSC-CMs分化15天后的基因表达。15天后，pluripotency gene (POU5F1)出现明显下调而心肌特异性marker MYH6出现显著上调。CXADR下降了2倍？WHY?

CXADR表达下降，作者的解释：CXADR expression in hiPSC-CMs is 30-fold less than that of primary adult human left ventricular myocardium sample (Online Figure IV). However, CXADR expression in hiPSC-CMs is 10-fold higher than in HL-1 mouse cardiac cells (Online Figure IV). These results demonstrate that hiPSC-CMs express CAR along with cardiac-specific markers.
？我不是很理解

2. Characterization of hiPSC-CMs Infected With CVB3-Luc

随后作者使用了hiPSC-CM/CVB3-Luc系统检测了the efficacy of antiviral compounds in abrogating viral proliferation in vitro。

药物列表

3. Quantification of CVB3-Luc Proliferation on hiPSC-CMs

4. Antiviral Drug Treatments Abrogate CVB3-Luc Proliferation

7. hiPSC-CMs Provide Mechanistic Insight Into IFNβ1-Induced Viral Clearance Pathways