ATAC-seq实战 0 Tn5转座

这篇文主要参考 Tn5 as a model for understanding DNA transposition，来了解Tn5的转座机制。

1. 转座概念
2. 参与分子
3. 转座过程

转座 (transposition)

可移动的DNA片段即可移动因子 (Transposable elements) 在基因组上自由转移称为转座，DNA与所插入的基因位点可以是非同源的。转座是产生基因多样性的重要机制，可移动因子可产生插入 (insertion)，缺失 (deletion)，倒置 (inversion) 以及染色体融合突变 (chromosomal fusion mutations)。[1]

转座需要通过转座酶的催化完成。根据 1）转座酶与DNA是否形成共轭中间体和 2）蛋白质活性残基 可以将转座酶分为5类： tyrosine (Y), serine (S), relaxase (Y1) and rolling-circle (Y2) , 这4类是转座酶与DNA形成共轭中间体；而第5类称为DDE转座酶，是通过酯基转移反应完成的。[2]

DDE转座酶的催化中心是由三个分离的区域N2，N3和C1，分别含有天冬氨酸 (D)，天冬氨酸 (D) 和 1个谷氨酸 (E) 组成，虽然三个区域间有不同长度间隔区，但通过蛋白质折叠形成三联体参与催化。

原核生物的转座分为两种方式，复制转座和保守转座。复制转座的供体DNA完整，把通过复制的DNA片段插入基因位点上；保守转座则是从供体DNA上分离一段DNA，以转座酶作为中介，连接到目标DNA上而实现的 (又被成为 'cut and paste' 转座)。

Tn5是极好的模型来研究保守转座模式。

参与Tn5转座的三个大分子

• 转座子 (Transposon) ：可移动DNA片段。
• 转座酶 (Transposase /Tnp) ：催化转座的蛋白质；野生型Tn5转座酶是一种活性极低的蛋白质。
• 目标DNA (Target DNA)：可以与转座子在同一个DNA分子上，甚至在转座子内；或在另一个DNA分子上。

1. 转座子

1. 简化的转座子结构：
   包含合成Tnp的DNA序列， 两个19bp 长的末端以及任意DNA序列。如图：

   
   
   simplified transposon

• 末端是两个19bp 长的片段，将Tnp和任意DNA序列包含在其中。有三种常见的末端：外端 (outside end /OE) ，内端 (inside end /IE) 和 镶嵌性尾端 (mosaic end /ME)。组合方式有两个反向的 OE， 或者两个反向的 IE，或者两个反向的 ME，又或者是两组反向的 OE 和 IE 组合。
  如下图所示， OE 与 IE 有7个位点的不同，但在 IE 没有Dam-DNA甲基化的情况下，两类末端都可被 Tnp 识别。而 ME 混合了这7个不同的位点，是一种比OE与IE活性更高的序列。
  

  End sequences

• 位于两个末端中间的DNA序列只需要满足长度足够即可。该长度要能保证 Tnp 在与两个末端结合后，Tnp 可以相互结合形成复合物。

2. Tn5 的转座子结构：
   Tn5 转座子是由两个反向的插入片段 IS50以及两组OE 和 IE 构成。

• IS50 包括三个抗生素抗性基因。IS50R负责编码Tnp和转座抑制物 (Inh), 而IS50L负责编码两个低活性蛋白。

Tn5

IS (insertion sequence): 插入序列，很小（< 2.5 kb）DNA片段，可以在不同的基因位点跳跃，或自我复制。通常存在于细菌与古细菌基因中，但也可存在于真核生物的转座元素中。编码的基因一般只与移动有关。 [2]

2. 转座酶

Tn5 Tnp 有476个氨基酸长； 属于IS4转座酶家族，其拥有YREK motif。
主要功能区：尾端DNA结合决定簇、二聚体结合域和活性位点 。

野生型 Tnp的主要特性是极不活跃 。在体外没有活性，而体内发生转座的概率仅为1/10^5细胞。通过四种类型的突变可使活性提升至少4个数量级：

1. 分离N端与 C端
以L372P为例，N端（含DNA结合域）与 C端（含二聚化结合域）相互抑制活性，导致这一现象的原因极有可能是两者之间距离太近。因此可以通过改变构象将两个结合域分离，从而提高活性。L372P是通过引入脯氨酸到靠近C端的α螺旋里，使得螺旋断裂，从而将C端拖离N端。

2. 提高Tnp与转座子末端的结合
以E54K为例，E54K提高了Tnp 与OE DNA的结合，而靠近 54残基的突变也可达到相似的提高效果。由此可见， DNA结合域的结构不是与OE 的结合的最优形态。其他研究表明，与IE 的结合也有相似的结论。

3. 形成直接的E-K相互作用，形成特定结构并与转座子末端的结合
E110 和 E345 残基通过形成 Mn++/Mg++盐桥。围绕在E345周围的残基（342，344 和348）能与末端DNA相结合， 说明110 和 345 残基形成的结构能够精准安排这个区域的残基与末端DNA结合。E110K或E345K的突变使得 110与345之间形成直接的E-K相互作用，由此削弱了盐桥的必要性。E-K相互作用可能改善了345区域结构而与末端DNA结合更易结合，或者在野生型Tnp中，没有足够的Mg++形成这个结构。

4. 提升形成 β-loop clamp的灵活性
242残基由P变为A/G将极大提高活性。这个突变提高了242-247在末端DNA上形成 β-loop clamp的灵活性。242的脯氨酸（P）是这的loop的基础，相较于丙氨酸（A）和甘氨酸（G），脯氨酸作为支柱更加牢固。

野生型Tn5转座酶是一种活性极低的蛋白质。这是因为要在宿主的生存和转座之间保持平衡。过多的转座将会导致基因功能的丢失。

YREK motif: 是 IS4 家族的主要标志之一。Y-(2)-R-(3)-E-(6)-K 位于 C1区域（DDE motif 谷氨酸 (E) 所在区域）。
DDE motif: D(60~110) D (100~150)E。

在IS4家族中的DDE和YREK motif

Tn5转座过程

组装过程是二聚体化的，双链DNA与转座酶的两个蛋白质亚基结合，引导转座子末端进入活性位点。[3]
酶与转座子结合→DNA切割 →目标捕获和链转移→分离与修复

Steps in Tn5 transposition

1. 结合
由于没有明确的证据，结合过程可以 1）如图中所示，两个单分子Tnp分别与末端DNA结合，然后两个单分子再形成二聚体；2）亦或者是二聚体Tnp先与一端末端结合，再与另一末端结合；3）又或者是两种情况同时发生。

• 结合的第一步必须包括Tnp的C端与N端分离；
• 随后Tnp与末端DNA结合：Tnp的 26-65 的残基与DNA 6-17 号位结合，大部分的结合位 '顺式' ，并且这个顺式结合有可包括342，344 和348残基；
• 接下来Tnp与末端DNA形成二聚化复合物：2个Tnp C端的α螺旋交叉而形成蛋白质-蛋白质结合。末端DNA 1-9 号位插入搭档单体Tnp的活性位点形成 '反式' Tnp-DNA结合，并靠近DDE区域。反式DNA结合十分重要，由于接下来所有的催化步骤都是反式的。

2. DNA切割
该阶段包括三个催化步骤：3'链断裂，发卡结构的形成和发卡结构的断裂。
Tnp的活性位点DDE残基配位两个Mg++，这两个Mg++作为亲核试剂激活氧原子，使氧原子切断P-O键。

• 首先，来自水分子的氧原子作为亲核试剂使两个末端转移链（transferred strand）的3'端断裂。
• 第二步，来自3'转移链的3'OH基团攻击非转移链（non-transferred strand）的5'端形成发卡结构。发卡结构使得转座子DNA从供体DNA中脱离。
• 5'非转移链发生了一些移动，使得发卡结构的断裂，并为目标DNA的接入腾出空间。

3. 目标捕获和链转移
在目标DNA捕获阶段，有一些序列产生偏移。由于两个3'OH基团相距41 Å，要稍远与所攻击的目标DNA两个磷酸二酯键之间9bp的距离。故这两个3'OH基团被镶嵌在一个可以容纳DNA的裂缝中，并且这个裂缝含有许多活性残基。DNA被捕捉到这个裂缝等待链的转移。
等DNA被捕捉后，两个3'OH基团攻击位于目标DNA上相距9bp的磷酸二酯键，完成转座子DNA到目标DNA的转移。在体外时，链转移的两个末端并不同时发生。

4. 分离与修复
体外与体内转座的重大区别体现在链与转座复合物的分离。
在分离后会有两个9bp的缺口在两个末端。

目标DNA最后产生9bp的重复在ATAC-seq后续分析里要处理。这个长度近似于一个完整的DNA螺旋。

References:
[1] Reznikoff W S. Tn5 as a model for understanding DNA transposition[J]. Molecular microbiology, 2003, 47(5): 1199-1206.
[2] De Palmenaer D, Siguier P, Mahillon J. IS 4 family goes genomic[J]. BMC evolutionary biology, 2008, 8(1): 18.
[3] Davies D R, Goryshin I Y, Reznikoff W S, et al. Three-dimensional structure of the Tn5 synaptic complex transposition intermediate[J]. Science, 2000, 289(5476): 77-85.