Abstract
代谢组学分析结合高级遗传群体是研究植物代谢组学的有力工具。然而，水稻（Oryza sativa）代谢组的遗传分析主要是利用自然资源或单个双亲群体进行的。本文以三个具有共同轮回遗传背景的染色体片段代换系群体的剑叶为材料，对水稻的代谢多样性进行了分析。通过将ACC10（A/Z）、Minghui 63（M/Z）和Nipponbare（N/Z）基因组片段引进珍汕97构建的多个相互关联的双亲群体，对代谢数量性状位点（mQTL）进行了有效定位。共产生1587个mqtl，其中684、479和722分别来自A/Z、M/Z和N/Z染色体片段代换系群体。我们鉴定了367个mqtl的99个候选基因。此外，通过25个候选基因的联合连锁分析，特异性地产生了1001个mQTL。其中一些候选基因被验证过，如LOC_Os07g01020与吡哆醇及其衍生物的体内含量有关和LOC_Os04g25980与顺式玉米苷葡糖基转移酶活性相关。我们提出了O-methylapigenin C-pentoside（O-甲基芹菜素C-戊糖苷）新的生物合成途径，并通过精细定位证明LOC_OS04G11970编码了该途径的一个组分。我们推测methylated apigenin（甲基化芹菜素）可能会赋予植物抗病性。这项研究证明了使用多个相互关联的群体能够生成大量可验证的mQTL。在功能代谢组学的背景下讨论了这些结果，并讨论了各自代谢物下候选基因的特征。
Introduction
大量代谢物由植物产生，其中许多是植物与环境相互作用所必需的。例如，水溶性B6组代谢物不仅在植物抗氧化防御中起作用，而且还可以减少重要的人类疾病的发生率，如高血压和糖尿病。同样，据报道，黄酮类等特殊代谢物参与了植物的生物和非生物胁迫耐受性，并对人类的慢性病和某些癌症具有防御的作用。因此，鉴于代谢产物的重要性，有必要进一步研究其在植物中的功能，探讨其对人类的价值。然而，据估计植物界产生了超过200000种代谢物，并且这些代谢物在不同物种中性质和数量存在很大的差异。因此，有必要更有效、更系统地揭示植物的代谢组。
代谢组学代表了实验系统生物学的一个主要工具，因此，它推动了对复杂遗传特征的理解，无论是单独使用还是与其他组学工具结合。近年来，利用多种代谢组学作为工具探索不同物种的代谢多样性以及通过研究种质资源来解释潜在的生物合成和调控途径方面取得了进展。尽管由于不明确的群体结构和有限的群体资源的限制，关联作图更为流行，已在多种物种（包括拟南芥、番茄、小麦和玉米）的单双亲分离群体中中进行了大量自然变异的mQTL分析。尽管有助于开发和高效地进行QTL定位），但在双亲群体中只有两个基因组的组合可能导致QTL定位的等位基因多样性不足。因此，这可能将mQTL的发现限制在双亲所表现出的多样性上。为解决这一问题，提出了玉米嵌套关联作图群体和多种作物的多个高级遗传互交群体作为多亲本群体解决方案。同时，已经证明利用多个双亲种群也可以提高作图的效率。
水稻是世界上最重要的作物之一，为全球人类消费者提供淀粉和许多其他营养物质。mQTL作图或全基因组关联研究结合代谢组学分析（mGWAS）已在水稻中进行，以解析代谢物含量调节的遗传基础。mGWAS分析提出了将水稻的两个主要亚种（籼稻和粳稻）的生物化学多样性归属于野生后代具有高度遗传多样性。鉴于代谢物与作物产量或营养之间的关系，预计mGWAS和mQTL研究将为理解水稻品种的生物化学多样性奠定遗传基础，并促进功能代谢组学方法应用于培育抗逆性增强和营养特性增强的优良品种方面。为了阐明这些重要代谢性状的遗传基础，我们在3个独立的CSSL群体中对281个代谢物进行了代谢谱分析。这些代谢物是由4个亲本产生的，包括2个典型的籼稻品种（明恢63[MH63]和镇山97[ZS97]），一个粳稻品种（Nipponbare[Nip]）和一个野生稻（Oryza rufipogon ACC10），使用ZS97作为共同的轮回背景，其他三个基因型作为独立的供体。结果证明，利用三个相关的CSSL群体可以获得更高的mQTL识别率和更有利于通路的解释。此外，联合连锁分析被证明在绘制某些代谢物图谱方面更为有效。这些联合观察表明，来自不同亲本的群体可能加速代谢产物的基因鉴定和途径阐明。我们随后鉴定和验证吡哆醇（维生素B6的维生素之一）和顺式玉米素O-葡糖苷侧的候选基因。此外，推测了甲基化芹菜素（C-pentoside）产生的生物合成途径。因此，综合结果表明，在鉴定和验证代谢物以及鉴定参与其各自生物合成途径的基因方面，使用这种遗传设计策略能起到很好的促进作用。考虑到候选的代谢物潜在抗病活性，通过代谢分析将为进一步研究特定代谢物提供关键线索。这些研究最终可能试图通过增强植物代谢以确保未来水稻产量中发挥至关重要作用。
Results
水稻旗叶的代谢谱
抽穗期旗叶采集自4个亲本系，即ACC10（野参）、MH63（籼稻品种）、Nip（日本品种）和ZS97（籼稻品种），以及利用这些亲本系（a/Z、M/Z和N/Z群体）建立的3个CSSL群体的个体，进行代谢谱分析。利用先前建立的广泛靶向代谢组学方法，在水稻旗叶中检测到281种代谢物（其中82种已被标准物质证实），包括29种氨基酸及其衍生物（AAs）、124种黄酮（Flas）、10种脂质（Lips），23个核苷酸，20个酚酰胺（PAs），30种植物激素及其衍生物（PHs）、36种多酚类（PPs）和9种维生素（Vits）。代谢多样性的主成分分析表明，四个亲本在其代谢组分上表现出重大差异。第一主成分和第二主成分（PC1和PC2）分别解释了总方差的41.7%和33.1%，且这些成分主要由不同的代谢物类别贡献：三个亲本（ACC10、MH63、Nip，与ZS97相比，Nip和ACC10中Flas和AAs的差异最大，而MH63中PPs的差异最大.接下来，我们对三个独立的CSSL群体中281种代谢物的变异系数（CV）进行了评估，结果显示，与A/Z和N/Z群体相比，M/Z系中相对较高的变异（CV为30%-90%）占比较低，表明这些代谢物在M/Z系间的变异较小。此外，与其余两个群体相比，M/Z系具有相对较高的代谢物遗传力。这三个CSSL群体的CV和遗传力的观察结果与MH63和ZS97之间的亲缘关系和M/Z群体的代谢多样性低于其他两个CSSL群体的结果是一致的。
不同CSSL种群中mQTL的bin mapping
在对不同品系进行代谢物分析之后，我们接下来根据CSSL群体的高密度图进行mQTL分析。共有684、479和722个mQTL分别对应于A/Z、M/Z和N/Z三个群体中的239、216和232个代谢物。去除彼此之间在1 Mb范围内的冗余mQTL，它们构成了1587个非重复位点。我们观察到多个热点的聚集，其中一些热点在不同的种群中是同域的。例如，43、42和54 mQTL被映射到染色体6上的8-12mb区块中，分别占A/Z、M/Z和N/Z群体中6号染色体上映射的mQTL总数的60.6%、45.7%和61.4%。其他热点主要定位在1号、7号和10号染色体上。
考虑到四个亲本系之间的变异是由不同种类的代谢分子引起的，可能不奇怪的是，各个CSSL群体的映射结果也有很大不同。在A/Z群体中，大多数代谢类（除了在N/Z系中最高的Flas；图2A）的mQTL映射更多，当考虑到每个代谢物映射的mQTL平均数时，AAs、PAs、PHs的映射结果可能更好。此外，更多的Flas候选基因是从N/Z系中特性获得的，而更多的AAs、PAs和Vits候选基因是从A/Z谱中获得的。AAs在A/Z群体和Flas在N/Z群体中的优先映射与相应群体中相应代谢物水平的增加变化一致。M/Z总体表现出较少的总mQTL，以及每个代谢物类较少的mQTL，并且在每个代谢物类中映射的映射间隔更宽。
除了分别利用三个定位群体（M/Z、A/Z和N/Z）外，还对整合群体MAN-Z（表明ZS97的染色体片段被MH63、ACC10和Nip的染色体片段所取代）进行了联合连锁分析，以提高定位结果。在此方法下，当与从单个CSSL群体获得的结果相比较时，每个代谢物类别获得更多mQTL，分辨率提高。这种趋势也反应在鉴定的每种代谢物QTLs的数量上，特别是Lips和PHs。例如，12mQTL被映射为来自三个CSSL种群的Lips的最高优势对数（LOD）值9，而54 mQTL被映射为联合种群分析后的最高LOD值19.5。类似地，分别从三个CSSL种群和联合种群mapping了70和140个PHs mQTL。仅通过该方法获得且在三个CSSL群体中的任何一个群体中都不存在的特定定位位点，进一步说明了整合群体能够增强定位性能。
代谢性状候选基因的鉴定
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鉴定mQTL的候选基因。一般来说，在映射间隔内或周围的基因注释（以及相应代谢物的化学特性）被评估为候选基因。例如，分别在A/Z和N/Z群体的1号染色体上的37.99-38.47-Mb和38.1-38.47-Mb间隔中mapping了几个AAs（Asp，m0018；His，m0036；和5-羟色胺，m0051）。LOC_Os01g65660/LOC_Os01g65670编码一个假定的氨基酸转运体，位于mapping区间内，由于其与拟南芥氨基酸穿透透性酶5（AAP5；At1g44100；该基因对于拟南芥中氨基酸的摄取和转运至关重要）的高序列同源性，被指定为候选基因。类似地，多个位点被映射为维生素B6的维生素之一的吡哆醇，包括染色体7中9.8至823.7kb的共同mapping区域，显示高LOD值。通过手动注释这个区域内的基因，LOC_Os07g01020认定为候选基因，因为与AT580140和At2g38230（氨基酸水平分别为85%和81%）的高度同源。据报道，这些基因催化拟南芥中维生素B6的生物合成。通过过量表达LooSo07G01020基因，证实了该基因能够增加吡哆醇和吡哆醇-O-葡萄糖苷的积累。通过该策略，从三个独立的CSSL群体中共鉴定了99个与367个mQTL相关的候选基因。
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上述候选基因分配策略对于间隔相对较窄的基因座是可行的，但对于跨越广泛染色体区域的mQTL是困难的。在这项研究中，几个黄酮类化合物，特别是m0424，O-甲基芹菜素C-戊糖苷；m0467，O-甲基芹菜素6-C-己糖苷；m0506，O-甲基木犀草素C-己糖苷；和m0545，O-甲基-黄樟醇C-己糖苷，分别被映射到4号染色体上的5.99-15.49mb区域，N/Z群体中的LOD值分别为69.8、116.6、82.1和71.8。在IL4和ZS97的F2子代1728个体中进行图位克隆，QTL被定位到4号染色体上的两个分子标记RM16492和ID3之间的约1.4MB区域。对BC1F2群体中另外2880株植物的进一步分析，进一步缩小了到了M23和RM16497之间34.8-kb的区间，该区间包含两个转座子、两个保守的亚基蛋白、三个表达蛋白和一个假定的O-甲基转移酶。因此，O-甲基转移酶编码基因LOC_Os04g11970被认为是最有可能的候选基因。三个亲本与ZS97相比，在Nip中这个基因3’端2bp的缺失，导致提前终止。这是引起N/Z CSSL群体中O-甲基芹菜素C-戊糖苷（m0424）含量降低的原因。通过对水稻种质的进一步研究，证实了多态性与代谢物含量之间的相关性（以m0424为例）。候选基因的功能在体内也得到了证实，在ZS97背景的RNA干涉（RNAi）植物中，相应的黄素含量显著降低。
image.png 对联合分析（MAN-Z群体）中明确识别的mQTL，候选基因也被分配和验证。……。综上所述，这些分析表明，染色体2（从A/Z群体定位的22.11-23.7Mb区间）、染色体6（分别从A/Z和N/Z群体定位的8.23-9.78Mb和8.37-10.61Mb区间）和染色体4（从N/Z群体定位的5.99-15.49-Mb区间）按顺序作用于芹菜素（m0164）中O-甲基芹菜素C-戊糖苷（m0424）的累积。根据先前的报告，LOC_OS06G18010和LOC_Os06g18670为第6号染色体上的mQTL候选基因，而LOC_Os04g11970通过精细定位推测为第4号染色体上的潜在基因，而第2号染色体上的潜在基因仍不清楚。
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结合上述分析和候选基因的注释，推测芹菜素首先被糖基化（由LOC_Os06g18010/LOC_Os06g18670催化），然后被O-甲基化（由LOC_Os04g11970催化）形成O-甲基芹菜素C-戊糖苷。为了证实这一观点，我们使用芹菜素和芹菜素C-己糖苷（相同摩尔浓度）作为底物进行了体外酶分析。与芹菜素C-己糖苷相比，芹菜素对LOC-os04g1970的相对催化活性极低（∼1%），表明LOC-os04g1970可能是芹菜素己糖苷甲基转移酶。。与此一致，在ZS97背景中敲除LOC_Os04g11970（对LOC_Os04g11970和LOC_Os06g18010/LOC_Os06g18670起作用）导致O-甲基芹菜素C-戊糖苷水平降低。然而，观察到这些Fla的含量在Nip为背景的野生型和LOC_Os04g11970过度表达株系之间没有显著差异。此外，甲基化的芹菜素可能具有抗病活性，LOC-os04g1190表达水平较低的个体，出现了一个更高的疾病指数。这进一步支持LOC_Os04g11970作为甲基转移酶发挥作用的观点。基于这些数据，提出了芹菜素生物合成邻甲基芹菜素C-糖苷的途径。
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Discussion
- 代谢组和遗传方法的结合已经成为研究mQTL潜在表型多样性的强有力的工具，其中应用到了两种定位策略。在这两种策略中，关联定位受到多种缺陷的制约，如未知的群体结构和难以检测的稀有变异。或者，许多群体可用于连锁定位，而双亲突变体的应用最为广泛，因为它们开发简单，检测qtl效率高。
- 然而，以前的mQTL研究主要采用单双亲群体，这可能导致许多被忽视的mQTL，因为只有两个基因组的重组导致用于QTL定位的等位基因多样性不足。因此，采用三个相关的双亲群体设计，通过将来自不同水稻亚种（特别是籼稻MH63、粳稻Nip和野生稻Accc10）的片段引入相同的遗传背景ZS97，提供了更丰富的等位基因多样性，而无明显的附加背景噪声。观察到的CSSL个体间的代谢变化暗示了遗传差异的原因（引入的片段）；因此，获得了许多mQTL。
- 长期以来，人们一直认为，籼稻和日本稻这两个亚种之间的显著差异是由不同的自然选择驱动的。同时，栽培稻的选择育种也引起了农业性状的显著变化。作为可能发生变化的表型性状之一，代谢物含量虽然可能只是间接选择的，但在选择过程中会经历与基因重塑相对应的逐步变化。因此，如果我们要充分利用功能代谢组学工具与其他组学工具相结合，以更全面、更精确的方式进行未来的水稻育种，就必须以更有效的方式了解遗传差异（基因型）与代谢差异（phe notype）之间的关系。
- 在这里，证明了三个供体亲本ACC10、MH63和Nip与ZS97相比，在代谢物种类上的代谢多样性。通过引入各自亲本的片段，CSSL个体间存在新的影响代谢物含量的等位基因变异（单核苷酸多态性[SNPs]/插入/缺失[InDels]），这些代谢物可以优先从指定的双亲群体中定位。
- 这就是说，在提出这一建议时，还没有对预测mQTL育种最佳群体的能力进行过实证检验，本文通过比较三种不同的种质资源得出的结果表明，可以忠实地进行预测，因此，这种预测可能有助于培育更有营养的水稻（氨基酸含量较高）。这不仅是该群体中AA含量的情况，在N/Z群体中优先定位的类黄酮也有类似的结果，这与其亲本之间的最高多样性水平一致。相比之下，M/Z群体在几乎所有统计特征中都不太突出，这可能是因为其亲本之间的代谢多样性较低（MH63和ZS97）。然而，值得注意的是，这也可能是M/Z种群中较小种群规模和较低标记密度的结果。
- 在解析功能代谢组组学的方法中，定位和鉴定决定代谢物含量差异的位点或基因是最关重要的一步。这些代谢物许多在植物与其环境之间的相互作用中发挥着重要作用。例如，稻米蛋白质含量是稻米的重要营养指标。尽管在分子水平上报告了与之相关的氨基酸渗透/转运体基因，但其中很少部分是通过遗传定位获得的。……
- 此外，认为黄酮类甲基化芹菜素可能具有抗病活性。为了验证这一结论，提出了三个证据，并对未来的研究方向进行了规划。
Conclusion
总之，在这项研究中，证明了使用相互关联的双亲群体不仅能够提供更高分辨率的mQTL，而且能够改进上位性相互作用的分析，从而重建O-甲基芹菜素C-戊糖苷的生物合成途径，并认为该代谢物具有抗病活性。
由于初级代谢物的变化可通过同位素追踪，这对次级代谢物代谢来说并不容易，因此本文和Kliebenstein等人的研究中所述的方法可能对于目前植物次生代谢的通路非常有用，从而提高我们对植物代谢的基本认识。最终，更全面的代谢通路将有助于在作物改良。
Reference
Chen, J , et al. "Metabolome Analysis of Multi-Connected Biparental Chromosome Segment Substitution Line Populations." Plant physiology 178.2(2018):612.