前言
Immugent在之前写过一篇推文：肿瘤淋巴结转移可诱导免疫耐受进而促进远端转移中，解读了一个关于肿瘤细胞淋巴结转移如何诱导免疫耐受从而促进远端转移的故事。这项研究可以说是Immugent看过的设计最精细、论证最扎实，以及结果最能反应本质的文章之一。虽然之前读过几遍了，但由于对它的印象极为深刻，因此最近又拿出来读了两遍。
毕竟是发表在Cell正刊上的文章，其研究内容也并不是所有人都能理解的。考虑到此因素，Immugent决定再来深入解剖一下这项研究，并对其中设计比较精妙的实验来进行举例解读。
不过，由于小编理解能力也有限，并且做过的实验也不多，并不能完全get到作者全部的精髓，还是需要提前给自己搞一个免伤buff。因此有小伙伴觉得理解不对的地方，可以通过后台联系我们，进行沟通交流。
主要内容
实验一：制备淋巴结转移肿瘤细胞系
文章的起点，也是特色之一，就是通过自体选择制备出不同亚型的淋巴结转移瘤细胞克隆型。其实这个实验操作不难，但是想法很大胆，而且是通过多次自体筛选出不同代数的淋巴结转移肿瘤细胞系。我们知道即使是肿瘤细胞系，但仍是一种程度很高的异质体，里面存在各式各样的克隆型，具体表现在其能否被免疫系统有效识别，以及能否具有进化出免疫逃逸的潜力。前者表现在其是否可以被机体免疫系统快速清除，后者这是和其能否成功进化出免疫耐受相关。在这个体系中，能被免疫系统快速有效识别的肿瘤细胞克隆型都会被机体很快清除；而正是有一些肿瘤细胞虽然可以被机体免疫系统有效识别，但是可以迅速进化出免疫逃逸的能力。这类肿瘤细胞就随后就可以逃避免疫系统的攻击，迁移到别处。
实验二：使用免疫缺陷鼠研究免疫细胞的角色
在讲实验设计之前先来普及一下基础知识：Rag2-/-小鼠体内缺少成熟的T/B细胞，是一种常用的免疫缺陷鼠；而Rag2-/-;Il2rg-/-小鼠体内则是除了缺少成熟的T/B细胞外，还缺少NK细胞，是一种更严重的免疫缺陷鼠；最后NOD-scid IL2Rgnull (NSG)小鼠，则是由Prkdc基因及Il2rg基因的敲除突变导致的免疫缺陷型小鼠，是目前免疫缺陷程度最高的工具小鼠。其小鼠缺乏成熟的T、B以及NK，且不生成免疫球蛋白，树突状细胞（Dendritic cells, DC）功能异常，非常适合人源细胞或组织移植。
作者为了研究淋巴结转移诱导的远端转移是否和免疫细胞攻击压力有关，而选择了这多种免疫缺陷鼠。首先是通过对比正常小鼠和免疫缺陷鼠（Rag2-/-;Il2rg-/-）肿瘤生长，证明了免疫细胞可以发挥抗肿瘤生长作用；更进一步的结果表明，与野生型移植淋巴结转移肿瘤细胞系相比，NSG小鼠的淋巴结转移的肿瘤不促进肺转移率，这表明淋巴细胞对肿瘤细胞的选择是促使肿瘤远端转移的主要诱因。
实验三：研究Treg功能的小鼠模型
为了研究Treg是否也在肿瘤远处转移中发挥作用，作者使用了Foxp3DTR小鼠，这种小鼠体内特异性缺少Treg细胞。作者在对正常小鼠以及Foxp3DTR小鼠静脉注射B16-F0-tdTomato细胞，随后发现全系统Treg的缺失可显著减少肺转移的数量。随后为了进一步研究Treg在肿瘤转移中发挥的作用，作者使用了FoxP3EGFP小鼠，这种小鼠产生的Treg都带有GFP荧光标记，因此我们可以通过检测GFP荧光强度来监测Treg细胞的功能。
实验四：区分来源和研究抗原特异性的小鼠模型
最后来说一下OT-I/OT-II小鼠，这两种小鼠体内都只产生OVA（Ovalbumin，卵清蛋白）抗原特异的T细胞，当OVA注射给小鼠会引发免疫反应。其中，OT-1小鼠是体内CD8+T特异性识别OVA；OT-11小鼠是体内CD4+T特异性识别OVA。因此，利用这两种小鼠模型，我们就可以研究抗原特异性的CD8/4T细胞的功能。这张图还涉及到另一种标记免疫细胞特异性来源的小鼠模型，就是CD45.1/45.2小鼠。这两种小鼠也是免疫学实验中经常使用的小鼠模型，一般在co-transfer实验中对不同来源的免疫细胞进行标记，
展望
不知道大家有没有和小编同样的感受，就是会打心底觉得遇到一篇好文章是很幸运的一件事。当读到一篇比较有学习价值的文章后，小编会觉得比吃一顿大餐还要开心；而且往往这类文章需要重复阅读，因为每次阅读后的感受不一样，收获到的知识也不一样。
对于这项研究来说，虽然得到的很多结果都是目前公认的，或者感受到的，但是其中的大多数都缺少坚实的实验数据来证实。而这项研究的作者不仅对每一个发现都进行足够的验证，而且还很巧妙的将它们串到一起，特别是对每一种免疫细胞在肿瘤微环境承担的角色都解释的非常到位。在遇到不同的生物学问题，作者都能做到使用最直接，最有力的实验进行论证，Immugent是觉得很受启发。
好啦，本次分享到这就结束了啦，欢迎大家批评指正~~
[参考文献]
Reticker-Flynn NE, Zhang W, Belk JA, Basto PA, Escalante NK, Pilarowski GOW, Bejnood A, Martins MM, Kenkel JA, Linde IL, Bagchi S, Yuan R, Chang S, Spitzer MH, Carmi Y, Cheng J, Tolentino LL, Choi O, Wu N, Kong CS, Gentles AJ, Sunwoo JB, Satpathy AT, Plevritis SK, Engleman EG. Lymph node colonization induces tumor-immune tolerance to promote distant metastasis. Cell. 2022 May 26;185(11):1924-1942.e23. doi: 10.1016/j.cell.2022.04.019. Epub 2022 May 6. PMID: 35525247; PMCID: PMC9149144.