文献学习018--[sc]单细胞测序鉴定出特殊炎性巨噬细胞亚群可作为减轻急性肾脏损伤的治疗靶点

今年刚发在Advanced Science上的文章，影响因子16.806。

1. Mononuclear Phagocyte Atlas at Single-Cell Resolution in Mice with IRI-AKI

Fig 1A：分选了肾脏缺血再灌NC，D1和D3的脾脏，肾脏和外周血的单核巨噬细胞，进行了单细胞测序。（整篇文章里面脾脏的细胞没有起到什么作用，感觉测不测意义不大）

脾脏：Cd11b⁺细胞
肾脏：F4/80⁺和Cd11b⁺细胞1:1混合
血液：Cd11b⁺和Ly6c⁺细胞1:1混合

Supplemental Fig 2A-C：质控后得到80829个细胞，根据MPC (mononuclear phagocytic cell) 的marker基因Cd68, Adgre1, Cx3cr1, Itgax, Cd209a, Clec9a的表达鉴定出8群一共28884个MPC。

Monocyte marker: Cd14, Ly6c2, Ccr2, Plac2
Macrophage marker: Csf1r, C1qa,C1qb, Cx3cr1, Adgre1, Cd68, Itgam
DC marker: Clec9a, Cd209a, Itgax

Fig 1B：对28884个MPC进行重新聚类和注释，得到32个细胞群。这里的注释是基于ImmGen数据库，用法之前写过，参考：单细胞文献阅读004--单细胞双组学技术揭示心脏中非心肌细胞的转录和表观层面异质性。从这儿也可以看到，有一些细胞数目比较少的群，注释不出来就大大方方写unknown呗，反正也不会影响主要结论。
Fig 1C：为了探究肾脏MPCs的器官来源，根据肾脏，血液，和脾脏在稳态下的独立的单核巨噬基因表达的基因集计算了不同时间点肾脏MPCs的来源（基于基因表达相似度）。结果显示D1的时候有74.69%的细胞来自血液，D4的时候减少到19.86%。

计算Fig 1c使用的基因

⚠️这个根据一些基因表达list看细胞处于哪个阶段的算法可以套用细胞周期评分。把周期基因换成上面表格里的基因即可。

Fig 1

Supplemental Fig 2

2. IRI-AKI的急性期，KRMs和Monocyte-Derived Macrophages起着互补的功能

Fig 2A：Ro/e值的热图。基于每个细胞群的the ratio of observed to expected cell numbers (Ro/e)来定量组织富集程度，发现MPCs细胞群显示出不同的组织偏好性。1, 2, 3, 4, 5, 10, 13, 14, 15, 16, 17和20群主要在肾脏样本中富集。

Ro/e应该是张泽民老师最早用的，最近老是看到这个，后续研究一下是怎么算的。

Fig 2B：分样本来源的umap图显示1, 2, 3和4群是肾脏稳态和IRI之后的主要的MPC群(结合Fig 1B)，而且这四群细胞表达经典的kidney resident macrophages (KRMs) markers比如C1qa, C1qc, Cd81, and Ms4a7 (见Figure S3D)。因此作者假定这四群细胞代表了组织原位巨噬细胞。
Fig 2C：四群肾脏组织原位巨噬细胞KRM的marker基因
Fig 2D E：使用AddModuleScore计算了四类KRM不同通路的评分，使用的基因如下，⚠️后面分析巨噬细胞的时候可以直接套过来用

⚠️⚠️⚠️这个可以直接拿来用（但是这明明Fig 2E和3B的图，table里写的Fig 2B...也是很不严谨了

Fig 2F：一样使用AddModuleScore计算的评分，不过横轴换成了时间点。
Fig 2G：在D1肾脏中新出现的细胞群C6, C7, C8, C9, C11, C12的marker基因表达。umap图上来看，这些细胞群主要来自血液和脾脏，提示这些细胞是单核分化来的巨噬。其中C6, C7, C8, C9这四群是Ly6c^hiIMs，C11和C12是Ly6c^loIMs (根据Ly6c的表达划分，参考经典和非经典单核细胞)。
Fig 2H：损伤后KRN，Ly6c^lo和Ly6c^hi巨噬细胞的通路富集结果，也就是直接去比较KRM (C1-C4) 与趋化来的Ly6c^hiIMs (C6, C7, C8, C9) 和Ly6c^loIMs (C11和C12) 的功能，选了每类细胞top10的通路一起画了气泡图。小标题的结论就是这张图得出来的。画法参考：一张图展示多组富集分析结果。

3. The Dynamic Functional Plasticity of Monocyte-Derived Macrophages in the Acute Phase of AKI

考虑到巨噬细胞在疾病进展中的高度plasticity，作者比较了Ly6c^hiIMs浸润进脾脏的表型和功能变化。
Fig 3A：D1时肾脏Ly6c^hiIMs和血液Ly6c^hiIMs的相比的差异基因火山图。发现促进单核向巨噬分化的Mafb, Jdp2, Rbpj 和 Mif在肾脏中高表达。一些趋化因子 (Ccl7, Cxcl3, Ccl12, Ccl2, C5ar1, Ccr1, Ccr5)，炎性调节分子(Il1b, Il1rn, Il1r2, Mmp9, Hmox1)和吞噬伴侣分子(Arg1, Stab1, Msr1)也在肾脏Ly6c^hiIMs富集。
Fig 3B：与Fig 3A中描述的基因上调一致，肾脏Ly6c^hiIMs的吞噬，趋化因子和炎性评分都要更高。（同Fig2 E）
Fig 3C：在浸润到肾脏之后，四个亚群的Ly6c^hiIMs（C6, C7, C8和C9）存在向Arg1^hiC5的分化。（这里的拟时序是用scVelo做的）
Fig 3D：计算了上述分化过程的拟时差异基因，分为了三个模块。module1(c6)主要在分化起始阶段的拟时基因，module3主要是在分化末尾阶段(Arg1^hiC5)的拟时基因。模块1包含各种促炎信号基因(S100a8, S100a9, Il18和C3)和炎性信号通路下游分子(Trem1, Ikbkb, Tnfaip3, Nfkbia和Ripk2)。模块1和2都包含趋化因子和受体(Ccl17, Cxcl10, Cxcr2和Ccr2)，提示增加的细胞迁移功能。模块3包含组织修复基因(Fn1, Pecam1, Vegf和Pdgf)
Fig 3E：三个模块基因的富集结果，和前面的基因表达几乎一致。模块1和2富集到各种炎症通路，模块3富集到组织有修复通路。（单核细胞到组织分化成巨噬之后促炎功能反而减弱？和既往理解不太一致吧？跟Fig 3AB也有点对不上）
Fig 3F G：四群肾脏组织原位巨噬细胞C1-C4和C5的拟时续发现在D1的时候，C4可以向C5分化，而D3时反了过来，C5出现向C4分化。
Fig 3H：和D1相比，D3的Arg1^hiC5开始表达KRM的marker基因，比如C1qa, C1qc, H2- Eb1和Cx3cr1。
Fig 3I：通过免疫组化验证了Arg1^hiC5这一群细胞的存在（只染Arg不太严谨吧，至少也应该是和单核/巨噬的一个marker共染才对）

4. S100a9^hiLy6c^hi Monocytes as the Earliest Blood Originated Responder to Renal Injury Signal

由于前面鉴定出了四群Ly6c^hiIMs在D1的血液中增加，而且出现在了受损的肾脏中，作者随后想要去确定是哪一群巨噬细胞最先对损伤做出响应。

Fig 4A：对D1的血液单核细胞进行scVelo速率分析提示S100a9^hiLy6c^hiC6群处于分化的starting point
Fig 4B：流式结果显示，S100a9^hiLy6c^hi单核细胞群在IR手术后2h即出现上升，是这个时间点肾脏中出现上升的主要单核细胞群。
Fig 4C：而且，S100a9^hiIMs在术后2h也在肾脏中升高。
Fig 4D：免疫荧光验证了术后2h肾脏中S100a8/a9⁺巨噬细胞的存在。
Fig 4E：为了确定是哪种趋化因子趋化了S100a9^hiLy6c^hi单核细胞，作者做了IRI后肾脏匀浆的chemokine array。发现存在着各种趋化因子如Cxcl1, Ccl2, Ccl3和Ccl22的升高。
Fig 4F：免疫荧光验证Cxcl1, Ccl2和Ccl3的表达。结果提示这些趋化因子在IRI之后2h后肾脏的肾小管上皮细胞表达。提示免疫细胞主要是肾小管上皮细胞表达。
Fig 4G：单细胞数据提示KRMs中有Ccl2和Ccl3的表达，提取可以被趋化。
Fig 4H：免疫荧光验证间质巨噬细胞Ccl2和Ccl3的表达
Fig 4I：KRM和四群细胞Ly6c^hiIMs的互作分析提示S100a9^hi Ly6c^hi monocytes (C6)和KRM的互作最强（怎么看出来的？细胞互作是用CellTalkDB做的）
Fig 4J：C6群单核细胞高表达Ccr1和Ccr2（Ccl2和Ccl3的受体），并且特异性的表达Cxcr2（Cxcl1的受体）。

这些数据提示S100a9^hiLy6c^hi单核/巨噬细胞可能是最早响应KRMs和TECs释放的早期肾损伤信号的细胞。

5. S100a9^hi Ly6c^hi Macrophages Initiate and Amply Inflammatory Injury in the Acute Phase of AKI

前面的结果提示S100a9^hi Ly6c^hi单核细胞最早响应肾脏损伤并迁移到肾脏组织分化成巨噬，作者随后想要去探究IRI肾脏中S100a9^hiLy6c^hiIMs(巨噬)的潜在功能

Fig 5A：和其他的Ly6c^hiIM群相比，S100a9^hiLy6c^hiIMs表达高水平的炎症相关基因如Il1b, Tnf, Tnfaip3, Il1r2, Il1rn, Cxcl2, Cxcl3, Ccrl2, Mmp8和Mmp9。
Fig 5B：同样的，S100a9^hiLy6c^hiIMs的inflammatory capacity，趋化因子以及趋化因子受体的表达评分也更高。
Fig 5C：S100a9^hiLy6c^hiIMs也富集到了一些炎症相关通路
Fig 5D：S100a9^hiLy6c^hiIMs与其他肾脏巨噬细胞的互作提示它和其他Ly6c^hiIM以及KRMs具有很强的互作。
这些结果提示S100a9^hiLy6c^hiIMs可能是IRI肾脏中炎症反应放大的关键细胞。
Fig 5E：STRING-db的PPI蛋白互作分析结果提示S100a8/a9的受体Tlr4和下游Nfb信号通路相关的蛋白在S100a9^hi Ly6c^hi IM中富集。
Fig 5F：而且这些通路的组分分子Myd88, Ikbkb, Saa3, Irak2, Irak3, Fos, Socs3, Nfkbia, Nfkb2和Junb在KRMs和Ly6c^hiIMs中都有表达。
Fig 5G：随后作者做了S100a9hi Ly6chi IMs and KRMs和Ly6chi IMs的互作分析，S100a9^hi Ly6c^hi IMs的S100a8/a9和KRMs 或Ly6c^hiIMs的Tlr4有强互作。
Fig 5H：免疫荧光结果也显示Tlr4在S100a8/a9⁺细胞高表达。
Fig 5I：而且肾脏S100a8或S100a9的表达与肾小管病理损伤评分和肾脏浸润的Cd11b⁺MPCs的数目呈正相关。

这些结果提示S100a9hi Ly6c^hi IMs可能在S100a8/a9-Tlr4轴的介导下，通过自分泌效应和活化其他巨噬细胞群的炎症反应放大炎症反应，恶化肾小管的病理损伤。

Fig 5

为了进一步探究S100a8/a9⁺细胞在人类AKI中的潜在病理作用，作者纳入了36例活检确诊的急性肾小管损伤(AKI)的患者。
Fig 6A：免疫荧光结果提示AKI的患者肾脏中S100a8/a9⁺的细胞主要是CD68⁺的巨噬细胞。
Fig 6B C： 正常肾脏组织中没有S100a8/a9⁺的细胞，而AKI患者肾脏中S100a8/a9⁺细胞明显增加，而且增加的水平和组织损伤程度及肾小管凋亡程度呈正相关。
Fig 6D-F：AKI患者的尿液中的S100A8/A9同样增加。而且增加的程度肾脏组织损伤程度及肾脏S100A8/A9的表达相关，但是与血浆的S100A8/A9水平不想关。

Fig 6

6. Targeting S100a8/a9 Signaling Protects against Kidney Injury in IRI Mouse Model

基于S100a9^hi Ly6c^hi IMs快速浸润进肾脏组织和促进炎症反应的特性，作者假设警报素复合体S100a8/a9可能是IRI-AKI的潜在治疗靶点。

Fig 7A：在uIRI-AKI模型中使用S100a9的抑制剂tasquinimod (TAS)和paquinimod (PAQ)查看治疗效果。这两个抑制剂可以结合S100a8/a9复合体，抑制复合体和TLR4的互作。（bIRI-AKI模型的治疗效果在Fig 9）
Fig 7B C：流式结果提示，和未治疗组相比，5mg/kg的TAS或30 mg/kg的PAQ治疗可以显著降低IRI后一天肾脏中的中性粒和巨噬细胞浸润，减少血中性粒和巨噬细胞的数目。
Fig 7D：免疫组化结果提示两种治疗也减少了肾脏组织S100a8和S100a9的水平，免疫荧光结果提示治疗也减少了S100a9⁺的巨噬细胞数目。
Fig 7E：western结果也显示，治疗可以降低受损肾脏组织中的Tlr4和p-Nfb的蛋白水平。
Fig 7F：各种炎症因子趋化因子如Il6, Il1b, Tnfa, Ccl2, Cxcl3, Ccr2和Cxcr2等的表达在治疗后也降低。修复性巨噬细胞的marker gene如Il-10, Arg-1和Chil3在治疗后则保持不变或出现了上升。

Fig 7

Fig 8A：与前面结果一致，治疗后肾小管的损伤也出现了减轻，-H2AX的表达降低，TUNEL结果也提示肾小管细胞坏死和凋亡减轻。
Fig 8B C：qPCR结果提示两种修复性生长因子Igf1和Egf在肾小管细胞中表达也上升（这是提了肾小管细胞做的qPCR？）
Fig 8D：治疗后Ki67阳性的细胞数目也出现了增加。
这些结果提示在抑制了AKI后的急性炎症后，肾小管细胞出现增强的再生潜能。
Fig 8E：治疗14天后，肾脏纤维化程度也降低。

Fig 8

前面Fig 7-8的结果都是在uIRI-AKI也就是一侧缺血再灌肾损伤模型上的出来的，为了进一步证实抗S100a8/a9的治疗效果，作者也在bIRI-AKI模型上进行了治疗。
Fig 9A：和Fig 7A一样，用了两种药物治疗
Fig 9B：两种药物治疗都可以降低uIRI-AKI的7天死亡率
Fig 9C：治疗后血浆肌酐水平也出现显著降低
Fig 9D E：肾小管细胞的坏死(D)和凋亡(E)在治疗后也出现减少
Fig 9F G：治疗后肾脏浸润的巨噬细胞和中性粒细胞也出现了下降

Fig 9

这些结果证实了在IRI-AKI中靶向S100a8/a9信号通路的治疗效果，表现为炎症反应和肾小管损伤的减轻以及增加的肾脏功能和组织修复能力。而且这种治疗还有可能通过减轻肾脏纤维化和降低IRI后的死亡率来改善预后。

总体上来说是一篇中规中矩的单细胞的文章，数据很多，思路值得学习。如果细节做的更好的话应该可以发到20分以上。