单细胞分析显示：NPAs作为新的血液预后生物标志物，在癌症患者中具有临床应用价值

Gene signature of circulatingplatelet-bound neutrophils is associated with poor prognosis in cancer patients

循环血小板结合的中性粒细胞的基因特征与癌症患者的预后不良有关

发表期刊：Int J Cancer

发表日期：2022 Mar 7

DOI：10.1002/ijc.33991

期刊相关信息

一、背景

        除了在止血中的关键作用外，血小板还与中性粒细胞发生物理相互作用，形成中性粒细胞-血小板聚集体（NPA），在炎症期间增强中性粒细胞效应器的功能。NPA还可能促进各种炎症性疾病的病情恶化。然而，癌症中NPA的特征仍然完全未被探索。    

        循环中性粒细胞的一个亚群——低密度中性粒细胞（LDN）在癌症患者的血液中扩散与预后较差相关，尤其是在非小细胞肺癌（NSCLC）和头颈癌（HNC）中。此外，发现相比于正常密度中性粒细胞（NDN），LDN显示出肿瘤中性粒细胞增强T细胞抑制功能。

二、数据来源和实验方法

1.数据来源

1）六名转移性NSCLC患者的全血；以年龄和性别匹配的对照组来自健康献血者（HD）的全血。

2）六名非小细胞肺癌(NSCLC)患者全血白细胞的ScRNA-seq数据（GSE127465）的CPM基因表达矩阵；健康献血者（HDs）全血白细胞的ScRNA-seq数据(GSE145230)的CPM基因表达矩阵。

2.实验方法

1）全血、NDNs和LDNs富集部分的制备，用于多光谱成像流式细胞仪；May Grünwald Giemsa染色

2）非小细胞肺癌患者（NSCLC）和健康献血者（HDs）全血白细胞的ScRNAseq数据预处理

3）差异性基因表达分析：从GSE127465 CPM基因表达矩阵生成的Seurat对象中，使用Seurat R软件包中的FindAllMarkers功能对两个不同集群之间进行差异基因表达分析

4）批量转录组数据的单样本基因集富集分析（ssGSEA）：GSVA R包中的SsGSEA对体外刺激和非刺激中性粒细胞（GSE15139和GSE49757）的公共微阵列数据进行分析

5）基于scRNAseq数据的单样本基因集富集分析（ssGSEA）并绘制barplot：escape包中的ssGSEA用于计算所有单个细胞的血小板特征“Raghavachari”和中性粒细胞特征“in house 11 genes”的富集分数。

6）MCP count on scRNAseq data

7）生存分析

三、实验结果

1.癌症患者和健康献血者（HDs）外周血中NPA的鉴定

        使用ImageStreamX（ISX）成像流式细胞仪，NPAs从NSCLC患者和HDs的全血中被鉴定为CD15+ CD14-中性粒细胞，其血小板糖蛋白4（CD36）和整合素α-IIb（ITGA2B，也称为CD41a）双重阳性（图1A，B）。此外，发现来自NPAs的CD36+和ITGA2B+血小板也表达P-选择素（CD62P）（图1B）。还可以通过May-Grünwald-Giemsa染色在未处理的NSCLC患者的全血涂片中轻松识别NPAs（图1C）。由于NPAs的频率被证明在各种病症患者的血液中比HDs要高，作者接下来通过ISX量化了NSCLC患者和HDs之间中性粒细胞中NPAs的频率。虽然NSCLC患者和HDs之间的NPA频率大致相同没有统计学意义上的差异，但与NSCLC患者和HDs的NPA平均频率相比，一名NSCLC患者显示出超过3倍的NPA比例（图1D）。有趣的是，在分析的所有六名NSCLC患者中，这名NPA比例高的患者也显示出迄今为止最高的NLR值，主要是由较高的中性粒细胞绝对数和最高的肿瘤负担。

图1    在 NSCLC 患者和健康供体的外周血中鉴定 NPA。

2.血小板优先与癌症患者血液中的低密度中性粒细胞（LDN）结合，而不是正常密度中性粒细胞（NDN）

        分析LDN和NPA之间的潜在联系后发现：与HDs相比LDN在癌症患者血液中的含量更高（图2A）。对NSCLC和头颈癌（HNC）患者血液中大量LDN和NDN的公开转录组数据（GSE79404）进行了单样本基因集富集分析（ssGSEA）发现：已发表的血小板特异性基因标记“Raghavachari”在LDN中的富集程度显著高于NDN（图2B）。接下来分离LDN和NDN，使用ISX流式细胞仪发现CD15+CD14-CD36+ITGA2B+CD62P+NPAs来自LDN而非NDN（图2C,D）。NPA约占LDN的2%，但在NDN人群中可忽略不计（图2C-E）。

综上所述，表明血小板优先与LDN结合，而不是NDN。

图2    NPA定义了NDN中没有的LDN子集

3.公共scRNA-seq数据集中NSCLC患者和HDs的全血白细胞NPA的鉴定

（1）NSCLC患者数据集【GSE127465】：在分析中使用了标准化计数表，并保留了原有的主要细胞类型注释，以确定血细胞群。重新分类所有白细胞（图3A）并区分六个中性粒细胞簇（命名为Neu 1、Neu 2、Neu 3、Neu 4、Neu 5和Neu 6），Neu 5簇与其他中性粒细胞簇不同，与血小板簇非常接近 （图3B）。发现通过MCP的方法计算的关于‘house 11 genes’评分，中性粒细胞显著高于血小板、单核细胞、B细胞/pDC，T细胞和NK细胞（图3C）；然后评估了已发表的血小板特异性基因标记“Raghavachari”在所有已识别聚类中的ssGSEA富集分数，与中性粒细胞、单核细胞、B细胞/pDC、T细胞和NK细胞相比，血小板簇是血小板特异性基因特征最丰富的细胞类型（图3D），两步实验都验证了标记的特异性。中性粒细胞特异性基因（CSF3R、CXCR2和FCGR3B）在所有六个中性粒细胞簇中的表达水平最高，包括Neu 5簇（图3E）。从基因水平来看，PF4、PPBP和NRGN这三个血小板基因是差异较大的上调基因，能够区分Neu 5簇与其他中性粒细胞簇和免疫细胞簇（图3F）。总之，表达血小板基因的中性粒细胞Neu 5簇似乎与NPA相对应。

图3    在NSCLC患者外周血白细胞的公共scRNAseq数据中鉴定表达血小板基因的中性粒细胞簇。

        为了验证这个含有NPA的表达血小板基因的中性粒细胞Neu 5簇不是这个特定的scRNAseq数据集所独有的，作者研究了HDs全血白细胞（GSE145230）的公共scRNAseq数据集中是否存在表达血小板基因的中性粒细胞。

（2）HDs数据集【GSE145230】：通过进行与NSCLC患者scRNAseq数据集（GSE127465）相同的分析，能够识别位于血小板簇和其他中性粒细胞簇之间的一个中性粒细胞簇（Neu 17）（图S1A，B）。与血小板、单核细胞、B 细胞/pDC、T细胞和NK细胞相比，中性粒细胞特异性基因特征“in house 11 genes”再次被证明对中性粒细胞具有特异性（图S1C）。血小板特异性基因标记“Raghavachari”也是如此，其在血小板簇中的平均ssGSEA得分显著高于中性粒细胞、单核细胞、B细胞/pDC、T细胞和NK细胞（图S1D）。与之前在NSCLC患者的scRNAseq数据集中发现的一致，部分Neu 17细胞表达高水平的中性粒细胞特异性基因（图S1E）和血小板特异性基因（图S1F），这表明表达血小板基因的中性粒细胞的鉴定可推广到任何人类的全血scRNAseq数据集。

图S1    在HDs外周血白细胞的公共scRNAseq数据中鉴定表达血小板基因的中性粒细胞簇。

      为了排除中性粒细胞中血小板基因的上调不是中性粒细胞活化的结果，作者测试了血小板特异性基因特征“Raghavachari”的富集是否在中性粒细胞活化时增加。使用了来自脓毒症患者的 GM-CSF 或血浆体外激活的中性粒细胞的公共转录组数据（GSE15139和GSE49757）。与对照相比，中性粒细胞中血小板特征的富集评分在激活时没有显著差异。

        因此，Neu 5 (GSE127465) 或 Neu 17 (GSE145230) 簇中血小板基因的表达似乎不是由中性粒细胞活化引起的。 总的来说，这些结果强烈表明：Neu 5 和/或 Neu 17 中性粒细胞簇展现出血小板基因的高表达，很可能含有NPAs。

4.NPA中性粒细胞基因特征显示脱颗粒、趋化性和跨内皮迁移能力增强

        为了在mRNA水平上更深入地研究非小细胞肺癌患者全血白细胞NPAs的特征，作者重点分析了非小细胞肺癌患者的scRNAseq数据集（GSE127465）。Neu 5簇中只有一小部分细胞表达血小板特异性基因（PF4、PPBP和NRGN）（图3F）。基于视觉细胞离散度，Neu 5簇比其他中性粒细胞簇更不均匀（图4A）。从整个Neu 5簇的437个细胞中选择了48个共表达三种血小板特异性基因（PF4、PPBP和NRGN）的细胞，命名为“Neu 5 PPBPhigh PF4high NRGNhigh”（图4A）。为了进一步确定NPA群中的中性粒细胞是否不同于任何其他中性粒细胞亚群，首先将NPA群（Neu 5 PPBPhigh PF4high NRGNhigh细胞）与每个中性粒细胞簇分别进行差异基因表达分析（图4B）。然后从每个成对的比较中获得NPA簇中上调基因的集合，共有191个基因。然后去除血小板基因（图4C），并确定了120个非血小板基因，这些非血小板基因可将NPA相关中性粒细胞与任何其他中性粒细胞亚群区分开来。

        接下来进行GO和KEGG分析，发现中性粒细胞脱颗粒/趋化相关生物过程、分泌颗粒相关细胞成分和跨内皮迁移相关KEGG基因集显著富集（图4D）。总的来说，这些数据表明NPAs相关的中性粒细胞显示出增强的脱颗粒、趋化性和跨内皮迁移功能。

图4    与其他中性粒细胞亚群相比，NPA基因特征在中性粒细胞脱颗粒、趋化性和跨内皮细胞迁移GO术语方面更为丰富。

5.在胰腺癌和肝细胞癌患者中，特异性NPAs相关的中性粒细胞特征与较差的预后相关

        接下来作者讨论了NPA相关中性粒细胞在不同肿瘤类型中的预后意义。第一步是产生特定的NPA相关中性粒细胞特征，排除其他非中性粒血液免疫细胞类型和在血小板中表达的任何其他基因（图5A），得到16个非血小板NPA相关中性粒细胞特异性基因（图5B）。使用人类NSCLC肿瘤样本的scRNAseq数据与之前使用的患者全血相匹配，随后排除了被多种其他肿瘤相关细胞类型高度表达的RBPJ、IDH2、HELLPAR和CCNI，从而产生最终12个NPAs相关的中性粒细胞特征基因（图5B）。接下来在发现集中验证了这个新的NPAs相关中性粒细胞特征的特异性，显示在12个基因的NPA相关中性粒细胞特征中至少有3个共同表达的细胞在肿瘤相关中性粒细胞中的富集程度明显高于肿瘤微环境中存在的任何其他主要细胞类型（图5C）。

        作者用TCGA数据库中的泛癌方法评估了12个中性粒细胞特征相关基因的预后价值（图5B）。为了进行比较还使用了中性粒细胞特征“in house 11 genes”来探究常规中性粒细胞的预后价值，在两个独立的scRNAseq数据集中证明了中性粒细胞的高度特异性（图5C）。通过进行多变量Cox分析，没有发现NPAs相关中性粒细胞特征与各种类型的NSCLC癌症患者、肺鳞状细胞癌（LUSC）和肺腺癌（LUAD）的预后之间存在任何关联（图5D）。然而，该特征与胰腺癌患者(PAAD)以及肝细胞癌患者 (LIHC) 的更差的无进展间隔期（PFI）和总生存期（OS）具有统计学相关性（图5D )。

图5    在胰腺癌和肝细胞癌患者中，特异性NPA基因特征与较差的预后相关。

        典型的中性粒细胞特征“in house 11 genes”无法概括 PAAD 和 LIHC 中如此重要的预后价值，更强化了NPA 相关中性粒细胞是具有不同临床结果的独特中性粒细胞群体的观点（图5D）。Kaplan-Meier 单变量分析还显示 PAAD（图 5E）和 LIHC 癌症患者（图 5F）中 NPA 相关的中性粒细胞特征的12个基因 的预后价值较差。典型的中性粒细胞特征“in house 11 genes”在PAAD癌症患者（图5E）和LIHC癌症患者（图5F）中均未显示与预后有任何统计学显著关联。这再次表明NPA相关中性粒细胞不同于典型的中性粒细胞。总而言之，肿瘤中存在的与NPA相关中性粒细胞所对应的中性粒细胞亚群可能对PAAD和LIHC癌症患者有不利影响。

四、结论

        作者的研究首次报告了基于人类全血白细胞scRNA序列数据在转录组水平上对NPA的鉴定和表征。基于转录组学特征，发现与NPA结合的中性粒细胞表现出增强的脱颗粒、趋化性和跨内皮迁移特征，它们将更有效地浸润肿瘤，然后促进肿瘤生长和转移。研究结果表明，来自NPA的中性粒细胞代表与LDN相关的中性粒细胞的一个独特子集。最后，利用TCGA数据库发现特异性NPA相关中性粒细胞特征与PAAD和LIHC患者的预后较差相关。因此，NPAs作为一种新的非侵入性血液预后生物标志物，在实体瘤癌症患者中具有临床应用价值。