火起来的“相分离”是什么？

Nature|doi:10.1038/d41586-018-03070-2

相分离或者说相变（Phase separation，Phase Transition）是目前比较火的一个研究领域，已有的研究表明相分离在细胞中普遍存在，与基因组的组装、转录调控可能密切相关，相分离的失调可能是一些疾病（如神经/肌肉退行性疾病）发生的病因，相关领域的科学家也开始通过相分离这个视角重新审视相关疾病，通过干扰异常“相分离”来达到治疗相关疾病的目的。
虽然最近经常听到“相分离”相关研究的讨论，但是对这个概念和它的应用依然很抽象。所以打算通过几篇文献简要了解下相分离的相关知识，主要从以下几方面总结：

• 相分离的概念
• 发展历史、发展现状和发展趋势
• 应用
• 相关技术，实验开展的难点是什么
• 对我们目前的研究有什么启示
• 相关研究者

1. 相分离是什么？

相分离或者相变（Phase separation）描述的是一种细胞里不同成分间相互碰撞、融合形成液滴，从而使一些成分被包裹在液滴内，一些成分被阻隔在液滴外的现象，类似于水油相混，或者可以想象成下雨天伞上的雨滴逐渐滴落的过程。这种现象在液体之间是常见的，但是，2009年，Brangwynne和Hyman关于线虫P颗粒的研究，发现P颗粒（一种蛋白质）并非像我们通常认为的是一种固体，而是像液滴一样，相互碰撞融合，剧烈摇晃后会分散成很小的液滴，而后又很快地融合形成大液滴。之后科学家发现细胞内的许多无膜细胞器——核仁、Cajal bodies、stress granules、miRISC，及突触的细胞骨架——都是特定的蛋白质/RNA的相变。

细胞内的相分离：
人们认为细胞内成分能够通过“相分离”的方式相互分开，实现多种生物学功能。“相分离”一旦发生异常，就可能造成疾病。

• 蛋白质或RNA分子间的物理作用力可以使他们相互分开或聚集。一旦分子达到一定浓度，他们就会发生相分离，相似的成分聚集在一起加速生物学反应（有点类似于相似相容），或者隔离无关的分子。
• 细胞膜上的信号传递
  在神经细胞中，细胞间的信号传递时蛋白质能够在连接处的聚集和相分离是保证细胞间信号传递正常进行所必需的。
• DNA折叠包装
  在细胞核中，相分离帮助压缩折叠不使用的DNA并抑制其活性。一些可能与转录相关的蛋白被阻隔在外。
• 液滴成为障碍
  在肌萎缩性脊髓侧索硬化症中，分离成液滴的蛋白质会逐渐凝结，变硬，形成有害的固体物质。

细胞内的“相分离”

2. 发展历史、现状和趋势

从2009年以后，“相分离”的研究开始出现。2011年，Hyman, Mitchison 和 Brangwynne发现核仁也有这种液滴现象。一年后，德克萨斯大学西南医学院的结构生物学家 Michael Rosen 和生物化学家Steven McKnight在实验的试管中发现RNA和蛋白质分子间存在较弱的作用力，彼此相互靠近，形成液滴类的物质。他们的研究与之前Brangwynne 和Hyman’s 的工作不同的是证明了相分离可以在试管中通过简单的生化反应重现。真正的研究热潮大概是从2015年初，加拿大多伦多儿童医院的结构生物学家Julie Forman-Kay团队发现，一种可能影响精子功能的蛋白质在人体细胞内形成液滴。2015年底，已有多项研究发现动物蛋白质存在相分离现象。

2018年的现状
不完全统计（需要补充），2018年CNS上已发表十几篇文章。

• 其中3月份Nature上发表了一篇文章介绍了相分离领域的发展历史和研究进展（https://www.nature.com/articles/d41586-018-03070-2）。
• 4月份，Cell上一次性发表了4篇文章还有一篇评论文章，介绍了对称或非对称精氨酸二甲基化做为翻译后修饰和核转运蛋白做为分子伴侣抑制FUS蛋白等RNA结合蛋白（RBP）的相关的“相变”（FUS全称为Fused in sarcoma，是一种渐动人症ALS中关键致病蛋白，也是一种RNA结合蛋白）。

DOI:https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.03.056
DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.03.003
DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.03.002
DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.03.004

• 6月份，Cell上发表了一篇综述，详细地介绍了相分离的概念，在无膜器官的形成、信号转导、细胞骨架、超分子组装等生物过程中扮演的功能。

DOI: https://doi.org/10.1016/j.tcb.2018.02.004

• 7月份Sience上发表了3篇文章和1篇评论介绍了相分离与转录调控。

DOI: http://dx.doi.org/10.1126/science.aar3958
DOI: http://dx.doi.org/10.1126/science.aar2555
DOI: 10.1126/science.aar4199
DOI: 10.1126/science.aau4795

• 12月份Cell上又发表了一篇文章介绍了转录因子通过液-液相分离激活基因表达实现其功能。

https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.10.042

3. 应用

随着相分离的研究逐渐增多，研究人员发现相分离在无膜器官的形成 ，信号转导、细胞骨架、超分子组装、基因的激活等扮演着功能，相分离异常可能导致疾病，如神经退行性疾病、肿瘤、衰老等。

• 神经退行性疾病
  相分离与神经退行性疾病联系起来的研究还是较多的，如：
  • 在肌萎缩侧索硬化（ALS）（一种运动神经元疾病）中观察到“相分离” ，发现FUS蛋白和hnRNPA1在ALS中形成液滴，液滴粘性逐渐变强，最终形成纤维状的固体，在ALS中异常沉积。
  • 阿尔茨海默病患者脑内异常沉积的tau蛋白也存在“相分离”，“相分离”可能是tau蛋白聚集的初始触发因素。
• 肿瘤
  相分离的异常可能促进某些癌症的发生。如分子病理学家Miguel Rivera和他的团队发现了一种与尤文氏肉瘤有关的蛋白。这种蛋白聚集在与肿瘤发生相关的基因组附近时可以激活致癌基因表达，而异常的“相分离”就可能促使这种蛋白在这些区域附近聚集。(DOI:10.1016/j.cell.2017.07.036).
• 保护作用
  除了对细胞的损伤作用，相分离还具有保护作用。Hyman和Alberti发现酵母细胞在低pH的压力环境下一些重要蛋白会聚集成液滴启动保护机制。当pH回升后，这些液滴会分散开，细胞恢复正常的功能。
• 基因组失活
  在人体细胞中，形成液滴更多的是一种组装策略。加州大学旧金山分校生物化学家Geeta Narlikar和她的团队发现，“相分离”帮助封存人体部分基因组，这些基因组永久不会被激活，主要发挥结构性作用（X染色体失活不知道是否和相分离相关）。
• 转录调控
  2018年Science和Cell上发表的几篇文章都是和基因调控相关。
  • （1）转录因子的低复杂度区域间的相互作用调控基因转录

原文：Imaging dynamic and selective low-complexitydomain interactions that control gene transcription
发表杂志：Chong et al., Science 361, 378 (2018)
发表日期：27 July 2018
DOI/html： http://dx.doi.org/10.1126/science.aar2555

许多真核生物的转录因子包含天然的、无序的、低复杂序列区域（ low-complexity sequence domains ，LCDs），但是这些LCD如何驱动转录激活还不清楚。这篇文章中研究者用活细胞单分子成像技术揭示了TF LCDs在外源性和内源性的基因组位点形成高度集中的相互作用中心。TF LCD hubs固定DNA的结合，招募RNA Pol II, 激活转录。hubs内LCD-LCD间的相互作用是高度动态的、并且选择性的结合辅因子，对己二酮的破坏敏感性也不同。在生理条件下，快速可逆的LCD-LCD相互作用发生在TF和RNA Pol II之间，没有检测到相分离。他们的发现可能揭示了转录调控的一种基本机制，同时也体现出了单分子成像技术在开发与疾病相关的基因调控相互作用的靶向药物中具有广阔的应用前景。
用到的技术和方法：

• 活细胞单分子成像技术
• synthetic LacO (Lac operator) arrays合成乳糖操纵序列和内源GGAA微卫星基因座
• CRISPR-Cas9基因编辑，诱变、基因激活、细胞转化实验以及各种高分辨率成像方法，包括荧光相关光谱、光漂白后的荧光恢复、晶格光片显微镜、三维DNA荧光原位杂交和活细胞单粒子跟踪。

从这些用到的技术中可以推测普通的实验室如果要开展这样的研究，可能需要有各种高分辨率的成像技术。

From hubs to phase separation: Activation occurs in a wide range of TFconcentrations

• （2）超级增强子通过相分离调控基因表达

原文：Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control
发表杂志：Sabari et al., Science 361, 379 (2018)
发表日期：27 July 2018
DOI/html： http://dx.doi.org/10.1126/science.aar3958

超级增强子（super-enhancer，SE）是由连续排列的增强子串联形成的增强子簇，决定细胞特性和功能的大多数关键基因附近通常伴随着出现超级增强子。这篇文章表明转录共激活因子BRD4和MED1可以在超级增强子处发生相分离形成液滴，将转录机器聚集在超级增强子附近，实现转录过程的区室化反应，其中内在无序区域（intrinsically disordered regions，IDRs）在相分离过程中发挥关键作用，这项研究为超级增强子通过相分离调控基因表达的模型提供了实验证据，也对细胞命运决定和疾病发生过程中关键基因的表达调控过程提供了全新的视角和概念。

Phase separation of coactivators compartmentalizes and concentrates the transcription apparatus

• （3） 转录因子在活化区域通过相分离激活基因表达调控

原文：Transcription Factors Activate Genes through the Phase-Separation Capacity of Their Activation Domains.
发表杂志：Cell 175, 1842–1855
发表日期：December 13, 2018
DOI/html: https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.10.042

这篇文章报道了转录因子OCT4和GCN4的转录激活结构域通过与转录中介体复合物Mediator发生液-液相分离激活基因表达，这项研究为我们进一步理解数百种其它的转录因子的功能机理，以及发育和疾病过程中基因表达调控机制提供了新思路。

Transcription factors (TFs) form phase-separated condensates with Mediator

• 重塑染色质结构
  11月29日，Cell杂志在线发表了Cliff Brangwynne课题组利用CasDrop体系的最新研究成果Liquid Nuclear Condensates Mechanically Sense and Restructure the Genome（DOI：https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.10.057）。该研究表明，细胞核内的“液-液相分离”现象能够感知并重塑染色质结构。

• 药物
  目前已经有通过相分离的手段治疗疾病的公司成立。如加州大学的细胞生物学家Ron Vale在今年年初成立了一家公司，主要通过破坏与神经退行性疾病（如运动神经元疾病、亨廷顿舞蹈病等）相关的RNA液滴进行药物研发。
  另外一个相分离研究的研究者Taylor也打算成立一个公司，将使用一个他们研发的工具“光颗粒（Optogranule）”识别药物靶点，这个工具能够再现细胞中“相分离”相关病理表现和过程。这项技术可以使研究者在几小时内观察到培养皿里神经退行性变化的过程。

相关技术，实验开展有什么难点？

相分离相关的技术有成像技术，首先必须有方法可以观察到这种相分离的过程；二是如何调控从而影响相分离过程的技术。
2017年，Brangwynne团队构建了一个光控系统（OptoDroplets），通过改变光的剂量，调控活细胞内不同液体成分的聚集程度，使液滴出现或消失。

OptoDroplets

2018年，Brangwynne团队又设计了CasDrop系统，可以定量、定位地研究多种蛋白的相分离现象。

CasDrop

相关研究者

• 普林斯顿大学副教授Clifford P. Brangwynne，他们关注相分离在生物过程中的形成、特性和功能，也在开发新的软件和技术研究用于相分离的研究。
  实验室主页: http://www.princeton.edu/cbe/people/faculty/brangwynne/group/，
• 马普所分子细胞生物遗传学的Anthony A.Hyman教授，实验室主页
• 待补充

参考资料

• Nature|doi:10.1038/d41586-018-03070-2
• 相分离：细胞生物学的百万美元难题

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