分析思考||单细胞转录组中实验步骤对分析有哪些影响

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一个好的数据就该和10X官网中3k pbmc的数据一样，分析起来如此丝滑。技术缺陷和实验步骤究竟制造了哪些问题，而生信又该如何解决呢？在此从细胞悬液制备到cell calling总结一下可能出现的问题。

//实验原理

先考古一下2017年10x Genomics 单细胞转录组的技术文献：Massively parallel digital transcriptional profifiling of single cells。

10x Genomics以droplet-based的方法为基础，开发出每个样本上万个细胞同时定量的3'端 mRNA测序技术。可以同时处理8个样本，6分钟完成，并有约50%的细胞捕获效率。在一个包含8个channel的液体环境的芯片上，带有功能序列的凝胶珠首先和细胞及试剂接触，随后使用有滴包裹进行反转录。功能序列包括测序接头、引物、14bp的barcode、10bp的UMI、30bp的oligo-dT序列。

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v2 Protocol ：16bp的barcode、10bp的UMI、30bp的oligo-dT。Read1包含barcode和UMI序列，Read2包含插入序列。

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v3.1 Protocol ：16bp的barcode、12bp的UMI、30bp的oligo-dT。

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//细胞悬液制备

从细胞悬液的制备开始，就有诸多因素影响后续分析。实验是生信的大冤种。

• 细胞凋亡、细胞损伤：线粒体表达过滤阈值相关。凋亡细胞MT线粒体基因表达升高，细胞质量差，细胞膜可能破裂，RNA丢失。但是线粒体基因表达高的细胞一定是低质量细胞吗？不同组织，线粒体表达也是有很大区别的，肝脏、心脏的表达相对较高。所以，阈值的设定要具体情况具体分析了，大部分文献采用的过滤标准5-20%。

1.Classification of low quality cells from single-cell RNA-seq data
2.The effects of death and post-mortem cold ischemia on human tissue transcriptomes

• 细胞悬液污染：细胞污染相关。如果制备细胞悬液时细胞破裂，mRNA散落在环境中，导致GEMs普遍污染。污染是必然存在的，轻微污染无影响，分析中只能观察到严重污染，所有细胞都表达其它细胞的marker基因。但是这种污染是细胞类型普遍、样本特异的。
• 组织裂解：细胞污染相关、Doublet相关。组织相对于pbmc多了一步裂解步骤，过度裂解可能细胞损伤，裂解不充分可能细胞黏连，最终形成Doublet或者Multiplet。Doublet的鉴定也难有统一的标准，可以分析前使用软件鉴定，也可以分析是人工鉴定，但敏感性降低。

1.Tutorial: guidelines for the computational analysis of single-cell RNA sequencing data

//细胞捕获文库制备

没有绝对的事情，再高端的技术也会有各种各样的问题。初次接触单细胞技术的培训是几年前了，当时却没有想过可能出现的一些问题。宣传说是细胞一个一个的通过，转录本通过UMI捕获，听者都以为是100%的事情。

• 细胞大小：细胞太大无法捕获。10X官方文档指出直径>30μm或者难裂解的细胞建议提取细胞核测序。

https://kb.10xgenomics.com/hc/en-us/articles/218170543-What-is-the-range-of-compatible-cell-sizes-

• 细胞悬液浓度：Doublet相关。浓度太大增大Doublet的比率，相同数据量的情况下，测序深度降低。
• 细胞mRNA含量：Neutrophil细胞因为RNA含量较低，而RNases和其他抑制化合物的水平相对较高，并且对降解很敏感，如果需要得到高质量的Neutrophil细胞，那在实验时就要采用更个性化的操作。

https://kb.10xgenomics.com/hc/en-us/articles/360004024032-Can-I-process-neutrophils-or-other-granulocytes-using-10x-Single-Cell-applications-

• doublet：双细胞在目前的单细胞技术中普遍存在，10X官网也给出了一些鉴定Doublet的方法。

1.https://kb.10xgenomics.com/hc/en-us/articles/360005165411-Are-there-methods-for-identifying-multiplets-

2.Benchmarking Computational Doublet-Detection Methods for Single-Cell RNA Sequencing Data

• dropout：单细胞转录组的主要问题就是dropout。对于一个GEM来说，细胞裂解释放的mRNA不可能全部被凝胶珠捕获，就会对本来有表达的基因，尤其是低表达的基因造成影响。imputation的软件有很多，但是否应该使用是个问题。

1.Tutorial: guidelines for the computational analysis of single-cell RNA sequencing data

//测序深度

海量的单细胞测序，应该使用怎样的测序深度？既要考虑测序成本、也要考虑分析效率，应该测更多的细胞还是更深的深度，好在10X 已经给了答案。通过对每个细胞50k reads的数据进行抽样，验证每个策略的表现。

• 测序深度对cell calling基本没有影响。
• 20k以上的深度是个不错的选择，Total Genes的数量曲线越来越平滑。
• 对细胞数目抽样的结果表明在细胞分类时准确度下降。而且细胞数量较少的细胞类型因为转录本捕获效率即dropout的问题，对分析也会产生影响。

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//细胞calling

文献速递||R包DropletUtils-基于droplet的单细胞转录组数据cell calling方法

• 细胞上样量：期望细胞数expect-cells参数的选择可能导致损失细胞，或者鉴定到假细胞。