文献学习010--[sc]重症新冠患者外周血抗原呈递细胞单细胞测序揭示多种抗病毒免疫过程缺陷

文章代码见：https://github.com/MelissaSaichi/Covid_scRNAseq.

主要发现：
1. plasmacytoid DCs促凋亡通路上调
2. pDCs和CLEC9a+DC分别有TLR9和DHX36的下调
3. 单核细胞亚群出现抗病毒的ISGs的下调
4. cDC1c+ DCs出现MHCII相关基因和MHC反式激活因子活性的下调，提示病毒抑制抗原呈递。

一. 所有样本整体情况分析

1. COVID-19患者的抗原呈递细胞(APC)亚群分布

该研究送了两批样本，第一批做discovery set，第二批做validation set。一共得到了81,643个APC，探索数据有42,784个，验证数据有38,859个。Fig1展示的是探索数据的42,784个细胞，分为6个亚群。

注释marker：
Mono marker：CD14和FCGR3A
DCmarker：CD1C和CLEC9A
CD14⁺单核细胞：CD14
CD16⁺单核细胞：FCGR3A
CD1c⁺ DCs：CD1c
CLEC9a⁺ DCs：CLEC9a
pDCs：TCF4, CLEC4C, IRF7, IRF8, LILRA4, IL3RA, TLR9, SPIB
AS-DCs：表达AXL和pDCs区分开

各型DC介绍：https://www.jianshu.com/p/a4acc7b618c0

2. APCs Inflammation-related pathways are hallmarks of COVID-19 APCs.

对三个不同分组的所有APC进行差异分析(Fig a, b, e)和富集分析(Fig c, d)。
差异分析计算的是该组和剩下两组的基因表达差异，比如Healthy组上调的基因是Healthy的APC和Moderate, Severe两组的APC相比的上调基因。图a展示了三组上调和下调的差异基因数，图b展示了Severe组和Healthy, Moderate两组相比top50的DEG。其中包括了促炎因子 (IL1B, CXCR4), 表面marker(CD36, CD83, AREG, ITGAM),酶 (CTSD, CTSB) and 分泌分子 (RETN, EREG, ANXA2)。
图c富集分析的结果所用的基因是moderate vs healthy和severe vs healthy。moderate患者高表达基因富集到了IFN-γ 和 IFN-α 反应通路，severe患者高表达基因富集到hypoxia 和 TNF-α 信号通路。图d是moderate vs severe的差异基因的通路富集结果。IFN-γ 和 TNF-α 信号通路可以被用于区分moderate和severe APCs。
图e画了moderate vs severe上下调基因根据log(FC)排序的线图

这里的富集结果也是HALLMARK基因集做的╮(╯ ╰)╭ ，这个geneset一共也就50个pathway，就这样给不同的病找了代表性pathway，对这种结果表示怀疑

3. Defective IFN responses in COVID-19 APCs.

a：既往研究显示，新冠患者出现外周血细胞因子的升高。和HC相比，患者外周血APC细胞表达IL1B, CXCL2, CXCL8 和 CCL3 增加，表达IL18下降。TGFB10在severe下调，在moderate没变化。IL6没有检测到。
b：尽管大多数细胞因子表达量低，富集分析却富集到了细胞因子信号通路相关的pathway。moderate和severe都富集到了IL6_JAK_STAT3’, ‘TGF-β’, ‘P53’, ‘TNFa_ SIGNALLING_VIA_NFKB’ and ‘KRAS_SIGNALLING’。

c：IFN家族是机体固有免疫和适用性免疫抗病毒反应最重要的机制之一。这里用scaled的热图展示了一些IFN相关基因在三组之间的表达（基因是挑的）。结果显示重症患者的APC的IFN相关基因表达水平较低，提示重症患者可能存在IFN相关信号通路的缺陷。
d和e：为了证实c的结论，用气泡图和小提琴图查看了一些抗病毒ISG和IFN信号通路的regulators在三组间的表达，发现这些基因的表达在moderate患者表达增高，在重症患者表达较低，与c图结论相一致。

图c, d和e展示的基因都是作者挑的，前面fig2已经有说了moderate患者高表达基因富集到了IFN-γ 和 IFN-α 反应通路，severe患者高表达基因富集到hypoxia 和 TNF-α 信号通路，那跟moderate患者相比，severe患者IFN相关的基因表达肯定低啊，出现fig3展示结果和结论不是很正常吗？感觉没什么意义

二. 每个细胞亚群的分析

前面Fig1对细胞进行了注释，Fig2和3查看了所有APC在HC，moderate和severe组中的变化，后面Fig4-7分别对pDC，单核，CLEC9A+ DCs和AS-DCs，CD1C+DCs这四类APC进行了分析，做的分析也都非常的常规，就是看看差异基因和富集通路，再选一些觉得有意义的基因看看表达差异。四个Fig分别得出了一开始写的那四条结论。
不过这里用到了之前没见过的转录因子活性预测工具，具体用法见DoRothEA：scRNAseq转录因子活性预测工具