生信分析学习笔记 - RNAseq (六)FeatureCounts

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       下图为某一条RNAseq从数据预处理,序列回帖到数据可视化的工作流程,包含了较多的软件(Linux环境运行)和若干个包(R语言环境运行),本系列将按下图,对每一个步骤进行学习和理解。

某RNAseq分析流程

FeatureCounts

FeatureCounts是一款超快速准确读段总结程序。

FeatureCounts是一款高度有效通用的读段总结程序,可针对不同基因组特征(例如,基因,外显子,启动子,基因体,基因组箱(*)和染色体位置)将已比对的读段进行计数。该程序可用来对RNAseq和基因组DNAseq读段进行计数。

输入与输出

FeatureCounts使用SAM/BAM文件以及一个注释文件(包括feature的染色体坐标)作为输入。程序会输出比对上不同feature(或多个feature)读段的数量。同时,程序也输出对总体总结结果的统计信息,包括成功比对的读段数和因不同原因未能成功比对的读段数。

注释文件应该以GTF格式或简化版的SAF文件作为输入。格式如下所示:

GeneID Chr Start End Strand

497097 chr1 3204563 3207049 -

497097 chr1 3411783 3411982 -

497097 chr1 3660633 3661579 -

Features和meta-features

所提供注释文件每一个条目都可视为一个feature(或外显子)。meta-feature是一组feature(或基因)的聚合。FeatureCounts使用在GTF文件中可获得的gene_id属性使不同feature分组到meta-feature中,也就是说,属于相同的meta-feature的不同feature拥有相同的基因id。

FeatureCounts能在每一个feature水平或meta-feature水平对reads进行计数。当在meta-feature水平总结读段时,对包含于相同meta-feature的features获取的读段计数将会被相加在一起,以生成相应meta-feature的读段计数。

读段与features的重叠

如果至少一个读段base被发现与feature重叠,该读段就与一个feature重叠。对双端测序数据,如果该碎片中两个读段中的任何一个被发现与feature重叠,该片段就被视为与该feature重叠。

默认情况下,FeatureCounts不会对与超过一个feature(或一个meta-feature)重叠的读段在相应水平进行计数。使用者能够使用 -O 选项命令FeatureCounts以计数此类读段(它们将会被分配给所有重叠的feature或meta-feature)。

需要注意的是,当在meta-feature水平进行计数时,与多个属于相同meta-feature的feature重叠的读段将总是被该meta-feature计算一次,使得对任何其他meta-feature没有重叠。

部分计数举例

使用5个线程总结单端读段数据:

featureCounts -T 5 -t exon -g gene_id -a annotation.gtf -o counts.txt mapping_results_SE.sam

总结BAM格式数据:

featureCounts -t exon -g gene_id -a annotation.gtf -o counts.txt mapping_results_SE.bam

同时对多个数据进行总结:

featureCounts -t exon -g gene_id -a annotation.gtf -o counts.txt library1.bam library2.bam library3.bam

FeatureCounts常用参数

-a # 输入GTF/GFF基因组注释文件(annotation file)

-F # 指定区间注释文件的格式,默认是GTF

-o # 输出文件:可输出raw counts的txt文本及raw counts的summary文本

-p # 针对paired-end数据

-g # 指定统计的meta-feature名称,默认是gene_id

-t # 指定统计的feature名称, 默认是exon

-T # 指定线程数

featureCounts的结果解析

Geneid:基因的ensemble基因号;

Chr:多个feature所在的染色体编号;

Start:多个feature起始位点,与前面一一对应

End:多个feature终止位点,与前面一一对应

Strand:正负链

Length:基因长度

sampleID:一列代表一个样本,数值表示比对到该基因上的read数目

MultiQC可以将多个FeatureCounts分析结果结合在一个网页文件,方便进行评估。

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