前言
前面，我们介绍过了差异基因的功能富集分析，今天，我们对这部分的内容作一些补充
主要介绍一下 GEVA、ssGSEA 和单基因的富集分析
GSVA
我们知道，GSEA 富集分析方法是针对两组样本来进行评估的，也就是说对基因列表的排列方式是根据基因与表型的相关度（例如，FC 值）来计算的，无法对单个样本使用
其富集分数（Enrichment Score，ES）的计算方式为
依次判断基因列表中的基因是否在基因集合中，如果在基因集合中，则 ES 加上该基因与表型的相关度，如果不是集合中的基因，则减去对应的值，最后可以计算出一个最大 ES。
Gene Set Variation Analysis（GSVA）与 GSEA 的原理类似，只是计算每个基因集合在每个样本中的 enrichment statistic（ES，或 GSVA score），其算法流程如下
不同于 GSEA 之处在于，对于不同的数据类型（只支持 log 表达值或原始的 read counts 值），假设了不同的累积密度函数（cumulative density function，CDF）
- 芯片数据：正态分布密度函数
-
RNA-seq数据：泊松分布密度函数
而且，GSVA 是为每个样本的每个基因计算对应的 CDF 值，然后根据该值对基因进行排序，这样，每个样本都有一个从大到小排序的基因列表
对于某一基因集合，计算其在每个样本中的 ES 值，也就是评估基因集合在基因列表中的富集情况。
例如，我们有一个排序后的样本
基因集合包含：B、E、H，我们可以绘制这样一张 K-S 分布图
x 轴为排序后的基因顺序，依照这一顺序，如果基因在集合内，则累积和会加上该基因的值（与基因的顺序有关，排名越靠前值越大），否则累积和不变。
将基因列表分为基因集内核基因集外两个集合，就可以绘制两个分布（红色和绿色曲线），分别计算两个分布之间的最大间距，以基因集内的分布值更大视为正间距（即红色曲线更高），两个最大间距之和即为该基因集的 ES 值
这样，就把基因水平的表达矩阵转换成了基因集水平的评分矩阵，可以使用差异表达基因识别算法，寻找显著差异的基因集，从而达到类似功能富集的作用
1. GSVA 分析
先获取基因表达矩阵，我们使用 TCGA 肺腺癌和肺鳞癌各 10 个样本的 read counts 数据
library(TCGAbiolinks)
# 获取表达矩阵
get_count <- function(cancer, n = 10) {
query <- GDCquery(
project = cancer,
data.category = "Gene expression",
data.type = "Gene expression quantification",
platform = "Illumina HiSeq",
file.type = "results",
sample.type = c("Primary Tumor"),
legacy = TRUE
)
# 选择 n 个样本
query$results[[1]] <- query$results[[1]][1:n,]
GDCdownload(query)
# 获取 read count
exp.count <- GDCprepare(
query,
summarizedExperiment = TRUE,
)
return(exp.count)
}
luad.count <- get_count("TCGA-LUAD")
lusc.count <- get_count("TCGA-LUSC")
dataPrep_luad <- TCGAanalyze_Preprocessing(
object = luad.count,
cor.cut = 0.6,
datatype = "raw_count"
)
dataPrep_lusc <- TCGAanalyze_Preprocessing(
object = lusc.count,
cor.cut = 0.6,
datatype = "raw_count"
)
# 合并数据并使用 gcContent 方法进行标准化
dataNorm <- TCGAanalyze_Normalization(
tabDF = cbind(dataPrep_luad, dataPrep_lusc),
geneInfo = TCGAbiolinks::geneInfo,
method = "gcContent"
)
# 分位数过滤
dataFilt <- TCGAanalyze_Filtering(
tabDF = dataNorm,
method = "quantile",
qnt.cut = 0.25
)
# 将数据拆分
luad.exp <- subset(dataFilt, select = luad.count$barcode)
lusc.exp <- subset(dataFilt, select = lusc.count$barcode)
我们使用 GSVA 包提供的 gsva 函数来将基因表达矩阵转换为基因集分数矩阵
library(GSVA)
library(GSEABase)
# 读取从 GSEA 官网下载的通路数据
c2gmt <- getGmt("~/Downloads/data/pathway/c2.cp.v7.2.symbols.gmt")
# 删选出常用的这三个数据库中的通路
gene.set <- c2gmt[grep("^KEGG|REACTOME|BIOCARTA", names(c2gmt)),]
# gsva 分析，read counts 使用泊松分布，通路至少包含 10 个基因
gs.exp <- gsva(dataFilt, gene.set, kcdf = "Poisson", min.sz = 10)
虽然 GSVAdata 包提供了通路数据 c2BroadSets 是基因 ID，但我们的基因表达数据的行是基因 Symbol，所以通路信息也必须是 Symbol 格式，要进行格式转换，比较麻烦
所以我们使用 GSEABase 包提供的 getGmt 函数来读取从 GSEA 官网下载的 C2 通路信息
得到结果如下，共包含 1511 条通路
然后，使用差异基因识别方法
2. 差异分析
我们使用 limma 分析差异通路
DEA.gs <- TCGAanalyze_DEA(
mat1 = gs.exp[, colnames(luad.exp)],
mat2 = gs.exp[, colnames(lusc.exp)],
metadata = FALSE,
pipeline = "limma",
Cond1type = "LUAD",
Cond2type = "LUSC",
fdr.cut = 0.05,
logFC.cut = 0.5,
)
通过设置 FDR = 0.05，logFC = 0.5 共筛选出 40 条差异通路
查看通路的火山图
我们可以一起看下基因的火山图
DEA.gene <- TCGAanalyze_DEA(
mat1 = luad.exp,
mat2 = lusc.exp,
metadata = FALSE,
pipeline = "limma",
Cond1type = "LUAD",
Cond2type = "LUSC",
fdr.cut = 0.01,
logFC.cut = 1
)
总共识别出 804 个差异表达基因
ssGSEA
single sample Gene Set Enrichment Analysis (ssGSEA) 是针对单个样本进行 GSEA 分析，其基因列表的排序方式和 ES 的计算方式都是依赖于样本中基因的表达值，而不再是依赖基因与表型的相关度
使用方式也很简单，只要在 gsva 函数中指定 method = "ssgsea"，例如
res.ssgsea <- gsva(dataFilt, gene.set, method = "ssgsea", kcdf = "Poisson", min.sz = 10)
也可以进行差异分析
DEA.ssgsea <- TCGAanalyze_DEA(
mat1 = res.ssgsea[, colnames(luad.exp)],
mat2 = res.ssgsea[, colnames(lusc.exp)],
metadata = FALSE,
pipeline = "limma",
Cond1type = "LUAD",
Cond2type = "LUSC",
fdr.cut = 0.05,
logFC.cut = 0.1,
)
或者绘制热图
annotation_col <- data.frame(sample = rep(1:2, each = 10))
rownames(annotation_col) <- colnames(res.ssgsea)
pheatmap(
res.ssgsea[rownames(DEA.ssgsea),],
show_colnames = F,
# 不展示行名
cluster_rows = F,
# 不对行聚类
cluster_cols = F,
# 不对列聚类
annotation_col = annotation_col,
# 加注释
cellwidth = 5,
cellheight = 5,
# 设置单元格的宽度和高度
fontsize = 5
)
单基因富集分析
单基因富集分析并不是说拿单个基因来进行富集分析，单个基因怎么能进行富集分析呢？一个基因根本没法进行统计检验。
其实，这里说的单基因并不是拿单个基因来富集，而是基于单个基因来进行富集分析，这个“基于”，就是以单个基因为基础，向外扩展，抓取与其相关的基因，然后用这些相关的基因来进行功能富集
所以，要理解这个单基因富集分析的意思，这样一说就已经很明了了。针对单个基因我们可以做什么？
主要有两种做法：
定性分组：我们可以根据给定基因的表达值对样本进行分组，然后识别在两组样本之间差异表达的基因，最后用这些差异表达基因来进行功能富集
定量相关：通过计算其他基因与目标基因表达之间的相关性，将具有显著相关的基因作为一个集合，也可以进行富集分析
1. 定性分组
我们以 CCDC134 基因为例，以该基因表达值的中位值来对样本进行分组
gene <- "CCDC134"
gene.exp <- dataFilt[gene,]
label <- if_else(gene.exp < median(gene.exp), 0, 1)
group.low <- dataFilt[,label == 0]
group.high <- dataFilt[,label == 1]
识别两组样本之间的差异表达基因
DEGs <- TCGAanalyze_DEA(
mat1 = group.low,
mat2 = group.high,
metadata = FALSE,
pipeline = "limma",
Cond1type = "CCDC134_Low",
Cond2type = "CCDC134_High",
fdr.cut = 0.01,
logFC.cut = 1,
)
共识别出 873 个差异表达基因
2. 定量相关
我们对其他基因与 CCDC134 基因进行相关性检验，由于基因较多，我们使用并行的方式来计算
library(future.apply)
batch_cor <- function(exp, gene){
y = as.numeric(exp[gene,])
gene_list = rownames(exp)
gene_list = gene_list[rownames(exp) != gene]
do.call(rbind, future_lapply(gene_list, function(x){
ct <- cor.test(as.numeric(exp[x,]), y, type='spearman')
data.frame(key = gene, gene = x, cor = ct$estimate,p.value = ct$p.value )
}))
}
plan(multiprocess)
system.time(res.cor <- batch_cor(dataFilt, gene))
对结果进行过滤，筛选出显著相关且相关系数的绝对值大于 0.6 的基因，共筛选出 232 个基因
cor.genes <- filter(res.cor, p.value < 0.05 & abs(cor) > 0.6)
3. 富集分析
格式化识别出的差异基因
library(clusterProfiler)
library(org.Hs.eg.db)
library(enrichplot)
gene.id <- bitr(
rownames(DEGs), fromType = "SYMBOL",
toType = "ENTREZID",
OrgDb = org.Hs.eg.db
)
go <- enrichGO(
gene = gene.id,
OrgDb = org.Hs.eg.db,
ont = "ALL",
pAdjustMethod = "BH",
qvalueCutoff = 0.05,
readable = T
)
dotplot(go)
gene_info <- DEGs %>%
rownames_to_column(var = "SYMBOL") %>%
inner_join(., gene.id[,1:2], by = "SYMBOL") %>%
# 必须降序
arrange(desc(logFC))
# 构造输入数据格式
geneList <- gene_info$logFC
names(geneList) <- as.character(gene_info$ENTREZID)
go2 <- gseGO(
geneList = geneList,
OrgDb = org.Hs.eg.db,
ont = "ALL",
minGSSize = 10,
maxGSSize = 500,
pvalueCutoff = 0.1,
verbose = FALSE
)
两种富集方法都没有富集到 go 通路，对于相关基因也是没有富集到通路的。选的这个基因不行