我们最近都在聊CRISPR-Cas9技术和TP53的关系，最近聊的两篇文章内容可以简述为：（1）CRISPR-Cas9诱导DSB，DSB激活P53，导致细胞死亡；（2）CRISPR-Cas9无法使得P53 mutant细胞死亡，从而富集P53突变细胞。那么CRISPR-Cas9是依赖DNA修复的技术，TP53是DNA修复的上游信号，是否CRISPR-Cas9对DNA修复功能也有影响呢？这一次，我们将解读一篇关于CRISPR-Cas9技术应用中，P53状态和DNA修复之间的关系。目前的思路图如下：
文献解读：CRISPR-Cas9在不同状态P53细胞中的DNA损伤修复情况
选文：今天挑的文章和我们讲的paper 1是同一天发表在Nature Medicine杂志上的。paper 1（下图上）作为letter形式发表而今天的文章是一个brief communication（下图下）。
1. 研究背景和问题
Cas9诱导的DNA双链断裂（DSBs）可通过非同源端连接（NHEJ）或同源重组（HDR）进行修复。修复机制的选择取决于细胞周期的不同阶段，在G1时NHEJ占主导地位（NHEJ在整个细胞周期中都有），而在DNA复制时HDR开始有效。这就导致依赖HDR修复机制的精准基因编辑效率低于NHEJ机制，这对于大部分肿瘤细胞来说HDR效率稍微低一点没什么，因其本身效率就很高。但对于正常细胞系，尤其是干细胞等，其HDR精准编辑难度非常大。虽然近年来已可通过（1）提高修复DNA模板浓度，（2）添加NHEJ抑制剂以及（3）优化转染等方式增加精准编辑效率。然而对于正常的、未转化的人类细胞的低精准编辑效率，其机制仍然未知。
2. 实验设计和结果
2.1 经典CRISRP文库筛选：dropout screens
方法介绍：下图a是一个经典的CRISPR文库筛选策略。选一定数量的细胞，转导CRISPR慢病毒文库并经抗生素筛选后将细胞分成两份，一份是initial sample（初始样本），一份是终止样本（细胞培养一定时间后/或经过实验处理）。通过比对初始样本和终止样本的sgRNA文库：（1）某些sgRNA已不再被检测到或者含量非常低，则可说明这些sgRNA编辑的基因是生长必须的基因；（2）某些sgRNA含量 比例增加，则一方面可能是其他sgRNA量的减少，导致这部分细胞比例增加，也有可能是这些sgRNA对调控细胞生长的基因进行了敲除或者抑制。
结果：
如下左图b：作者选用永生化的视网膜色素上皮细胞 （retinal pigment epithelium，RPE）进行CRISPR文库筛选：部分细胞在被敲除生长必须基因后应该死亡，则针对这些基因的sgRNA不应被检测到，而他们检测到了。对sgRNA进行统计后发现P53-P21-RB1等基因的sgRNA序列高度富集。因此作者推测是P53-P21-RB1轴的失常，导致细胞在被敲除生长必须基因后仍能存活。
如下右图c：为验证P53-P21RB1轴失常对维持细胞生存的作用，作者对RPE P53+/+和P53-/-细胞进行全基因组CRISPR文库筛选，将对细胞生长必须的核糖体基因进行分析：（1）P53-/- RPE 有相当一部分细胞的核糖体基因含量很少，说明在没有正常核糖体基因的情况下仍能存活。（2）而P53+/+ RPE细胞都有较高含量的核糖体基因，说明被敲除核糖体基因的细胞已经死亡。总得来说，在该死的时候，p53-/-细胞不死。经过前面两篇文章的解说，我们很容易认为这是由于P53缺失，导致凋亡诱导失败造成的，但是不是呢？
解读分析：在正文中有很短的一段话衔接，虽然结果在中文和补充材料中我都没找到。作者发现P21 sgRNA的富集仅仅出现在P53+/+中，在P53-/-则无P21 sgRNA富集。因此作者认为，P21的缺失仅仅在P53+/+的时候，才能给细胞提供生长竞争优势。由于P21是P53调节细胞周期的重要下游因子，因此作者假设，CRISPR-Cas9诱导DSBs触发了通过p21和pRB介导的短暂的、p53依赖的细胞周期阻滞，而与靶向位点无关。注意这里提到了与靶点无关，即只要达到细胞周期阻滞效果皆可，不一定是P53缺失。这里就为后面的研究做了前因后果铺垫，这也是本文与同一天发表的另外一篇文章的不同之处。
2.2 P53状态对细胞周期的影响
方法介绍：
（1）上文提到短暂的细胞周期阻滞，因此作者选用了瞬转的CRISPR-Cas9方法：即直接将Cas9蛋白和sgRNA的复合物投放到细胞中，这个复合物叫做核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP）。
（2）此外，还设计依赖HDR的CRISPR-Cas9精准修复实验BFP-GFP实验，如下图b所示：细胞原本带有mutant GFP-2A-BFP元件，由于GFP是突变的无法发光，因此细胞只表达蓝色荧光，通过HDR精准修复mutant-GFP后，被修复的细胞同时发蓝色和绿色荧光。
解读分析：从上图a结果可看到，经由RNP瞬时CRISPR-Cas9基因编辑时，P53-/-细胞其周期没有特别改变，而p53+/+细胞则出现G1期增加（NHEJ增强），G2/S期减少的情况（HDR减弱）。
2.3 细胞周期与HDR精准编辑的关系
鉴于HDR主要在S期中激活，作者认为P53WT细胞的由于P53激活导致G2/S期细胞减少，从而依赖HDR 的CRISPR-Cas9精准编辑效率不如p53-/-细胞。为了验证这个假设，使用了上图b中的BFG-GFP实验。从下图结果可看到，确实p53-/-组的绿色荧光细胞更多，证明p53-/-的精准编辑更多。
同时作者使用细胞周期抑制剂--CDK4/6抑制剂palbociclib，将细胞周期阻滞在G1期，此时G2/S期细胞会变少，可以看到HDR精准编辑的效率下降。这一个实验非常重要，因为P53+/+细胞的低编辑效率也可以是因为细胞的死亡，就如前面paper1我们提到的那样，这里使用细胞周期抑制剂，使得两者的相关关系，进一步往因果关系靠拢。
2.4 验证性实验：P53激活剂和抑制剂
接下来是两个在P53研究中非常常用的抑制剂和激活剂。
P53抑制剂MDM2：如下图e，P53在常规情况下被MDM2泛素化，最后被运送到蛋白酶体降解，这就是P53在正常细胞中维持非常低水平的原因。而外加MDM2则可降低Cas9诱导DSB时诱导的P53水平，使得HDR精准修复效率更高。
P53激活剂Nutin3a：如下图f，Nutin3a通过抑制MDM2作用，使得P53不再被泛素化，P53蛋白得以稳定于细胞中，此时HDR精准编辑效率降低。这部分的结果进一步证实P53与HDR精准编辑的关系。如果可以的话，最好把细胞周期结果补一补，进一步验证“P53-细胞周期阻滞-HDR精准修复效率”这个机制。
综上所述，P53激活导致的细胞周期阻滞会降低HDR精准编辑效率，而抑制P53可以增加精准编辑的效率。
3. 未解决问题
即使短暂的P53抑制都有可能会导致染色质重排或者基因损伤修复失败，从而积累DNA突变，对后续应用造成影响，因此需要进一步的工作去验证短时P53抑制对细胞的影响。在这里不得不佩服大课题组的敏锐嗅觉，这篇文章发表于2018年6月份，就在2019年就已有关于瞬时抑制P53对细胞基因组或功能影响的研究，且该文发表在干细胞领域top期刊cell stem cell上，下次我们将来解读，别人是如何解决这个问题的。
结语
别看这篇文章只是brief communication，文章篇幅虽短，但是实验设计十分精巧。尤其是如何摆脱P53和凋亡之间的关系，转而研究细胞周期这部分，做了很好的衔接。早在2019年我也读过这篇文章，从前读文章只会看结果，让自己强行接受作者的观点。而这次有了前面几篇文章的铺垫，我开始会横向比较这些工作的不同，以及他们如何确定自己的方向。白天太忙有时候无法思考，到了晚上躺在床上拿出手机细细的看，写写笔记，越看越对头。最近已经爱上了这样的文献阅读方式，假以时日，我们期盼能把P53和CRISRP-Cas9之间的经典文章都过一遍，组成自己的小宇宙。同时在文末不断的强调这是学习笔记，希望大家多多反馈交流。也在这里像广大小伙伴发出邀请，如果您也想一起看文章，请在评论抠1，但最终还是要围绕自己的可以读文，还是有个轻重缓急。
我们最终的目的还是：一起学习！
前期文章：
- 我们用两篇文章的篇幅大概讲了一遍质粒骨架及其各个要素的介绍：
解剖式学习一个质粒结构--update
质粒系列之什么是质粒 - 再谈了最传统的限制性克隆：
质粒系列之限制性克隆--restriction cloning - 前面还夹杂的讲过一些piggybac、gateway、RMCE的一些内容：
基因编辑如何换药不换汤 - 慢病毒系列也有讲过两篇：
团队作案HEK293，史上最强搬砖细胞
不想再用慢病毒了，我还有什么别的选择吗？piggyBac transposon - 此外我们本还有一个CRISPR screening的专题，只有开头，未得完善：精准大海捞针--5. CRISPR screening专题
- 质粒系列之再谈无缝连接--Gibson assembly
- Golden Gate，质粒改造的王者
- 关于CRISPR-Cas9技术的脱靶效应：CRISPR-Cas9基因编辑--脱靶效应如何检测
- CRISPR和TP53文献解读之：Cas9诱导P53激活并导致细胞死亡
- CRISPR和TP53文献解读之：Cas9活性可筛选P53突变细胞