Non-genetic evolution drives lung adenocarcinoma spatial heterogeneity and progression
--cancer discovery 29.47
思路
挑选出以某一组织类型为主的TCGA肺腺癌病人→发现不同组织学类型的这种基因突变特征不具有特异性→不同组织类型的表观层面表现出明显的差异性，且同组织学类型一样，具有这种progression特点→通过表达矩阵计算非肿瘤成分，发现，pattern progression 与immune 浸润相关。
→作者选取了10个具有两种组织类型以上的肺腺癌病人，纯化出特异的组织进行测序→在单个肿瘤内这种不同组织类型差异的基因和甲基化确实对组织类型起到了关键性的作用。
→单细胞测序获得肿瘤特异基因→lepidic/solid差异分析，得到特征性的基因→揭示lepidic到solid的表观现象→构建L2S signature→这种signature 与预后相关，与免疫相关，且在多个数据集得到了验证
→通过多色免疫荧光，定量荧光信号，蛋白空间组学探讨了LUAD组织类型的免疫浸润情况，从表观，空间，TLS揭示了不同组织学类型的免疫微环境特点
一、abstract
①从惰性到侵袭性模式的转变不是由genetic alterations驱动的，而是由（epigenetic and transcriptional reprogramming reshaping）表观遗传和转录重编程重塑癌细胞特性驱动的。
②在多个人类队列中，量化这种转变的特征是患者预后的独立预测因子。
③在单个肿瘤中，高度复合的蛋白质空间分布显示免疫沙漠、炎症和排斥区域共存，与组织学模式组成相匹配。
④我们的结果提供了肺腺癌肿瘤内空间异质性的详细分子图谱，追踪了癌症进化的非遗传途径。
二、Statement of significance
①我们分析了肿瘤内部模式和预测患者预后的分子标记物的非遗传机制
②肿瘤内模式决定了不同的免疫微环境，在当前免疫治疗的背景下值得研究。
三、Introduction
①LUAD患者间和患者内的分子多样性并不完全是遗传的。转录和表观遗传异质性在患者之间和患者内部都有报道
②组织异质型最常见的模式分为鳞状、乳头状、腺泡状和实性（图1a），80%的LUAD肿瘤同时表现出至少两种模式。
③目前在同一肿瘤中测量分子和组织型异质型受阻
④LUAD组织学模式的分子特征和肿瘤微环境的形成在很大程度上是未知的。
⑤在这里，我们从原发性人类LUAD进行组织病理学引导下的多区域取样，以解剖对应于独特组织学模式的肿瘤区域。
⑥我们在2000多个独立患者队列的LUAD样本中验证和评估了我们结果的预后意义。重要的是，这些过程都不能追溯到特定的遗传变异，但能知道表观遗传和转录重编程。总的来说，我们确定了支持 non-genetic的致癌过程和空间特征，作为LUAD异质性和进展的驱动因素。
四、result
1、患者间组织学模式的分子异质性
①我们首先检查了癌症基因组图谱（TCGA）队列（5）中206个LUAD样本的分子特征，这些样本根据其最常见的模式进行了注释：鳞状（n=8）、乳头状（n=47）、腺泡状（n=86）和固体（n=65）（补充表1）
②不同组织学类型的样本具有相似的肿瘤分期分布（补充图S1a），但实体型肿瘤显示出显著更高的肿瘤突变负担（TMB-图1b），106与最近在独立队列中的观察结果一致（27），编码基因的拷贝数改变数（补充图S1b）
③这一趋势的一个显著例外是lepidic注释肿瘤样本（TCGA-44-7670）。然而，在回顾了为该数据集提供的虚拟载玻片后，我们发现在提交分子分析（01A-TS1）的肿瘤区域和提交病理学回顾（01Z-DX）的肿瘤区域中存在高度不同的组织学模式，这表明肿瘤内异质性可以解释这种不一致性
④预测的neoantigens与TMB成比例增加（补充图S1c），可能预测组织学模式中的不同免疫原性。
neoantigens--肿瘤新生抗原，肿瘤突变产生的肿瘤特异性蛋白
⑤除少数115PIK3CA突变主要发生在lepidic病人（8例病人中有3例，adj。p值=0.0004），并且solid样本中TP53突变比例较高的趋势（adj。p值=0.096）（补充图S1d和补充表2）。
⑥在东亚血统（28）的LUAD患者的独立数据集（EAS-补充图S1e，f）和最近分析的临床队列（27）中证实了solid-prevalent肿瘤中高TMB和TP53突变之间的关联。相反，在这些队列中没有发现PIK3CA突变的关联。其它候选的weak mutation 也没有发现关联，总的来说，我们的结果表明组织学模式和LUAD遗传特征之间的关联有限。
⑦相反，具有不同流行模式的TCGA样本表现出高度不同的转录和表观遗传学特征（补充表3），其差异表达基因或甲基化探针至少比偶然预期的多两倍（图1d，e）。
⑧组织类型的进展表现出相同的差异倍数在差异表达的基因表达和差异甲基化位点处（s1g、1f）；事实上，在大多数病例中观察到一致的阳性或阴性基因表达（图1g-顶部）或DNA甲基化（图1g-底部）折叠变化，表明组织学模式并不代表四个独立的分子表型，而是由表观遗传和转录重编程驱动的从lepidic到solid的转变。
⑨与实体腺癌相比，鳞癌中上调的基因富集到的功能通路是细胞分化、发育和形态发生方面，而实体腺癌富集到的是细胞增殖和免疫浸润（1h，1i）。这种转录的差异在其它两个数据集得到了验证（s1h，s1i）；启动子甲基化区域的功能富集到了相似的通路，得到了相似的结果。（1i），这证实了随着肿瘤的进展与肿瘤的免疫浸润相关。
⑩我们根据转录数据计算了肺肿瘤细胞成分，鳞癌样本富含肺泡alveloar 和epithelial marker ，支持鳞癌和正常肺组织的相似性特征。尽管淋巴细胞和髓样细胞始终富集在腺泡--acinar和solid sample中。整体上来说这些结果表明，LUAD pattern 的 progression 与肿瘤细胞和微环境的progressive reprogramming相关。
然而，迄今为止所分析的分子图谱是从单一肿瘤样本中产生的，这些样本以主要的组织类型进行注释；因此，尚不清楚相似的特征和可塑性是否可以在单个肿瘤组织类型中观察到
2、肿瘤内分子组织学异质性
①为了确定单个肿瘤内组织学模式进展的分子特征，我们选择了10个早期LUAD原发性患者样本的队列，每个样本至少显示两个不同的模式（CHUV队列，补充表5），并进行组织病理学引导的多区域取样。对于每位患者，我们回顾并解剖福尔马林-165固定石蜡包埋（FFPE）组织切片上的肿瘤区域，使每个区域由一个独特的模式组成（图2a）。
②我们总共收集了29个肿瘤区域和10个正常组织样本。这些样本通过全外显子组测序、RNA测序和DNA甲基化EPIC array（见方法）进行处理。LUAD驱动突变主要是克隆性的，即在所有区域都观察到，并且与特定模式无关（图2b）。在大多数情况下，我们确认了更高级模式中更高TMB的趋势（补充图S2a）。
③差异表达的基因和甲基化探针聚集在一起，并注释相同的模式（图2c和补充图S2b，补充表6）。我们队列中模式间的转录差异与TCGA和EAS队列中观察到的一致（补充图S2c、d和补充表7）。
④事实上，鳞状细胞样本中过度表达的基因在组织发育和形态发生中得到了富集（图2c-蓝色簇），而固体样本，尤其是腺泡样本，表现出免疫浸润标记物的过度表达，特别是B细胞（图2c-橙色簇）。在固体样本中过度表达的基因在细胞增殖和基质金属肽酶（MMP）基因过度表达的标记物中更具特异性（图2c-红色簇）。鳞片和固体相关基因都富含细胞外基质（ECM）成分和调节因子（图2c），尽管发挥着相反的作用
⑤事实上，在固体样本中上调的ECM基因大多富集于ECM降解（例如MMP基因）和胶原蛋白（例如COL1A1和COL1A2），已知其激活可改变细胞粘附并促进侵袭（34）。反之亦然，在lepidic样本中过度表达的ECM基因包括几种介导细胞粘附的蛋白质（35）（例如TNXB、FBLN5和MFAP4）和假定的肿瘤抑制因子（例如DLC1（36）和FOXF1（37））。重要的是，这些基因的表达与单个肿瘤的模式进展有关（图2d）
⑥同样，从基因表达（32）预测的免疫浸润在10名患者中有8名患者中从lepidic增加到实体模式（图2e），肿瘤内模式显示正常肺组织标记物（富含鳞片）和免疫细胞标记物（富含腺泡和固体）的富集程度不同（补充图S2e）
⑦基因表达和甲基化的差异指出差异指出肿瘤的内在（分化、迁移、增殖）和外源性（免疫浸润）过程是LUAD组织学模式的关键决定因素
3、癌细胞可塑性是组织类型进展的基础
①对3个LUAD样本（38）的单细胞RNA序列数据进行了分析。肿瘤和非肿瘤细胞之间的差异表达分析使我们能够提取2410个基因，仅在肿瘤细胞中高表达（肿瘤特异基因，图3a，参见方法）。
②我们在我们的队列中选择在lepidic和实体肿瘤区域之间显著差异表达的癌症特异性基因（adj p值<0.1和绝对倍数变化>2），以确定lepidic（n=36）和实体（n=21）癌细胞标记物（图3b）。
③这些基因证实了细胞增殖（固体）和分化（lepidic）方面的富集（图3c和205补充表8）。
④接下来，利用这些基因作为lepidic和solid 模式的癌细胞标记，我们得出每个癌细胞的转录分数，以量化它们的lepidic-like 或solid-like转录状态（见方法）。来自例患者样本的单细胞转录分数显示出与可塑性重编程一致的状态转变（图3d）：来自样本S1的细胞主要表现出鳞状特征，取而代之的是样本S2中含有失去鳞状细胞标志物的肿瘤细胞，并表现出实体标志物的可变表达，最后样本S3 是跨越从鳞状细胞到实体的整个转变的复合细胞（图3d）。
⑤为了探索这些转录变化的起源，我们通过算法预测了哪些主要转录调节因子（TRs）最有可能调节鳞片和固体样本之间差异表达的基因（39）。结果在TCGA和我们的队列中非常一致（图3e），在固体主TRs中鉴定出了细胞周期调节因子，如E2F转录因子、minichromosome maintenance（MCM）复合成分，它们调节DNA复制和延伸，以及叉头盒M1（FOXM1）转录因子--它是一个关键的在多个癌症中细胞增殖相关的调控子。
⑥在lepidic master TRs中，我们发现了与肿瘤抑制功能相关的基因，如昼夜节律阻遏子CRY2，其降解MYC癌基因（41），锌指转录因子ZBTB4（42），以及参与细胞分化和发育的转录因子，如CASZ1（43,44）和YAP抑制子WWC1（45,46）。在TCGA和我们的队列中，lepidic主TRs和lepidic 癌细胞标记物在固体样本中平均表现出较高的启动子DNA甲基化（补充图3a），表明lepidic TRs和标记物的下调至少在表观遗传沉默的部分驱动。有趣的是，来自高通量CRISPR敲除筛选（47）的数据显示，在肺腺癌细胞系中，富含solid 型的TRs的丢失在很大程度上是有害的，并且许多（尽管不是全部）被归类为必需基因，因为它们在细胞增殖中的作用（图3f）。相反，在相同的细胞中，敲除富含lepidic模式的TRs会对细胞活力产生中度影响，有时甚至改善细胞适应性（图3f），这与假定的肿瘤抑制功能一致
⑦接下来，我们结合肿瘤特异性鳞癌特异性标记和固体标记，生成独特的mRNA信号，并量化lepidic到固体过渡（L2S签名）。TCGA和CHUV 样本中的L2S特征分数与患者和肿瘤内分类以及模式进展（补充图3b，c）一致，并且，事实上，正常肺组织的分数最低，其次是鳞状、乳头状、腺泡状，最后是实体样本，平均分数为最高分。有趣的是，L2S分数正确预测了误注TCGA样本（TCGA-23744-7670–图1c）的模式，与基于主导模式的分类不同，它将TCGA 样本分层，其预后显著不同（图3g和补充图S3d）。
⑧来自10个患者队列（5,23,28,31,48-51）。多变量Cox回归分析证实，除受试队列（即100多名患者组成的队列）外，肿瘤分期和L2S评分均为正交独立预后因素（图3h、补充图245S3e和补充表1）
⑨此外，在所有队列中，L2S评分与预测的鳞片和solid TRs活性（补充图S3f）和微环境组成（图3i）密切相关。有趣的是，L2S评分与免疫细胞标志物的相关性最高的是T细胞衰竭标志物，这表明免疫逃避的机制发生在具有实体模式特征的肿瘤样本中。
4、LUAD组织学模式的肿瘤微环境
①我们的L2S信号与独立LUAD患者队列中的免疫浸润之间的可重复关联（图3i）促使我们研究肿瘤免疫微环境的空间组成与不同的模式。首先，我们用多色免疫荧光法分析了FFPE肿瘤组织切片，这些切片来自我们的患者队列和另外3个实体型的患者，以检测增殖细胞（Ki-67+）、B细胞（CD20+）、CD4+和CD8+T细胞以及巨噬细胞（CD68+）。我们分别通过苏木精-伊红（H&E）染色（图4a）和TTF1染色（图4b）来区分LUAD模式和肿瘤细胞，以及通过设计空间网格量化方法（GridQuant）量化荧光信号强度（图4c），该空间网格量化方法260平均可变大小像素内的荧光信号（图4d，参见方法）。
②这些分析揭示了不同LUAD模式下免疫细胞浸润的程度和地理组织的显著差异。与其他模式相比，实体区域显示出更强的Ki-67强度，而免疫细胞标记物随着模式进展而增强，但在腺泡区域最高（图4e）。
③有趣的是，我们在几个肿瘤中发现了三级淋巴结构，有时表现为类似生发中心的增殖B细胞的Ki-67阳性核心（图4f-右）。TLS的形成与改善预后和免疫治疗反应相关（52,53），因此我们评估了其在样本中的分布。我们在载玻片中自主识别出所有TLS，发现正常肺组织和鳞状细胞癌区域中没有TLS，但腺泡区域中普遍观察到这些TLS，乳头状和实体区域中的TLS较少出现（图4g）。总之，这些结果表明，免疫浸润增加随着模式的进展，但免疫浸润最大的是腺泡，而不是固体模式。
④接下来，我们通过评估肿瘤细胞和非肿瘤细胞的共定位，研究了不同模式下肿瘤微环境的空间组织。TTF1+和TTF1-信号在正常肺和鳞片区呈正相关，可能是由于存在细胞缺失的肺泡结构，在乳头和腺泡区缺乏相关性，但在实性区高度反相关（图4h），符合癌细胞和非癌细胞的低混杂性。
⑤类似地，免疫细胞标记物和Ki-67的共定位（此处可用于标记肿瘤细胞）（补充图S4a）实体型最低，在独立像素大小区域下（补充图S4b）。
⑥与这些趋势一致，我们注意到淋巴细胞和巨噬细胞在单个肿瘤切片内的实体区域边界定位（图4i）。为了量化这些观测结果，我们使用网格量提取了从每个实体瘤区域的外围到其核心的距离的平均信号强度（图4j）。在所有病例中，免疫细胞的密度在周围高于肿瘤区域的核心（图4k，l），表明在固体模式下免疫细胞的空间分布与免疫排斥表型一致。
⑦为了证实这一证据并更详细地探讨肺腺癌核心和外围的分子结构和免疫微环境，我们在5例患者的5张组织切片上进行了数字空间分析（DSP-Nanostring GeoMX）。简单地说，在每张玻片中，我们用58个抗体选择并分析了12个感兴趣的区域（共60个ROI），位于不同组织学模式的核心或外围（补充表9和补充图S5a）
⑧ROI定位与免疫浸润无关，通过CD45阳性细胞比率或蛋白表达测定，除了实体ROI（图5a）。事实上，患者8的6个实体ROI中（图5b），其中2个位于肿瘤核心（R9和295R8），免疫浸润水平最低，4个位于肿瘤外围（R6、R7、R10、R12），均表现出高免疫浸润（图5a）。
⑨固核ROI表达高水平的癌细胞特异性标记物（PanCK和EpCAM）、Ki-67和白细胞介素7受体（IL7R或CD127）（图5c）。尽管IL7R在肿瘤细胞和免疫细胞中都有表达，但这些roi中免疫细胞含量较低，提示IL7R在肿瘤细胞中有表达。更重要的是，在非小细胞cell肺癌中，癌细胞表达IL7R与预后不良相关（54）。相反，外周ROI表现出免疫细胞标记物的高表达，包括免疫抑制调节性T细胞（T-regs）标记物Tim3和免疫检查点VISTA（图5c）。
⑩实体瘤核心区和周围区的免疫浸润程度差异很大，这就挑战了比较肿瘤细胞或免疫细胞的特异性特征的可能性。为了克服这一挑战，我们分析了来自3个实体瘤区域的36个额外ROI，并且在每个ROI中，我们分别分析了免疫细胞（CD45+）和癌细胞（PanCK+）（图5d，补充图S5b）。
通过选择性地保留来自一个或另一个细胞群的信号（参见图5d中掩蔽策略的示例），我们首先比较实体瘤区域核心和外围的癌细胞。在这里，我们发现外围的癌细胞实际上表现出明显更高水平的增殖标记物ki-67，与浸润边缘以及Pan-312AKT和p53一致。
（11）其次，尽管实体ROI核心区处的免疫浸润较低，但核心区和外围区CD45+细胞的特异性比较显示，实体区核心区处浸润的免疫细胞明显富集了免疫抑制效应因子T-regs的标记物，如FOXP3、CD25和Tim3，免疫检查点，如CTLA4、VISTA和ICOS（图5f，补充图S5c）。总的来说，尽管所有实体瘤都表现出免疫排斥的特征，但残留的免疫浸润与免疫抑制微环境相一致，特别是与效应子T-regs的存在相关。
四、Introduction
①在分子水平和组织水平上，患者之间和患者内部的癌症异质性都很明显。然而，基因组特征如何以及是否决定了细胞形态和空间组织在很大程度上还没有被探索。
②我们通过介绍一种基于组织病理学指导的多区域取样的方法来调和肺腺癌的分子和组织学异质性。
③我们的结果显示肿瘤进化的非遗传机制是决定组织异质性和疾病进展的因素。事实上，从lepidic到实体组织学的进展与分化细胞标记物的可塑性重编程、细胞增殖增加以及从免疫沙漠（lepidic）到 炎症（乳头状，尤其是腺泡状），最终排除和抑制（固体）微环境的转变有关。重要的是，肿瘤细胞的内在特征和微环境332的相互作用在单个肿瘤中都有明显的转变，并且肿瘤内部的模式异质性也很匹配
④伴随着癌症细胞的塑料重新编程和微环境变化的同时，人们对这种变化的起源提出了疑问。肿瘤细胞分化是否激活特异性免疫形成和反应？或者，肿瘤免疫微环境的动态变化是否触发了癌细胞的可塑性？为了解决这些问题，需要模拟人类疾病转录、表观遗传学和形态学特征的肺腺癌模型
⑤人类肺腺癌组织学类型已经在小鼠中得以构建。
⑥有趣的是，即使通过选择具有独特模式特征的肿瘤内区域，我们也没有找到将这四种模式区分为独立类别的标志物。相反，我们的结果表明两种极端状态之间的过渡，鳞片状和实性，其中乳头状和腺泡状可能是中间状态。
⑦早期肺癌患者内的肿瘤组织学异质性更明显一些
⑧随着新数据的出现，在佐剂和新佐剂环境下测试肺腺癌组织学类型组成或特征与ICI（免疫靶点抑制剂-PDL-1）反应之间的关系将是一个有趣的问题。
⑨协调分子和表型异质性是理解和整合癌症进化的遗传和非遗传机制的关键的第一步
五、方法
1、statistical analysis
hi-Square, Fisher, 392Kruskal-Wallis, t, Wilcoxon Rank-Sum, correlation coefficients；
Dunn and Tukey post-hoc tests were performed with 394R packages ‘FSA’ and multcomp’
Multiple hypotheses corrections were made using Benjamini-Hochberg procedure.
2、TCGA data
Neoantigen counts were retrieved from https://gdc.cancer.gov/about-406data/publications/panimmune (73)
3、CHUV data
13 adenocarcinomas were selected ,at least 2 of the main histological pattern
4、other dataset
Chen/EAS (28) dataset including somatic point mutations, copy number changes, gene expression profiled by RNA sequencing, H&E stained images and clinical data was downloaded from OncoSG (75,76).
TRACERx (12) raw RNA sequencing 440data for each tumor region was downloaded from the European Genome-Phenome Archive (ID: 441EGAS00001003458) and processed as described in the paragraph ‘RNA sequencing and data 442processing’; lymph node metastases were excluded;
gene expression datasets 444were downloaded from Gene Expression Omnibus (accession numbers, respectively: GSE37745, 445GSE31210, GSE72094, GSE68465, GSE50081)
CRISPR 到底是一种怎样的技术？
TTF-1在病理诊断中的意义
空间蛋白组学：NanoString 数字化基因检测技术（nCounter Analysis)及最新发布的数字式空间多靶标分析系统 （Digital Spatial Profiling， DSP）是最新一代的多重核酸定量技术和空间组学研究技术。其中DSP通过颠覆性的空间组学技术，可以在单张FFPE或者新鲜冷冻组织样本上一次性测定多达96个蛋白，并于一天之内可以处理多达20个样本，无需额外生物信息实验就可以当天拿到数据。从去年预售发行到今年为止，已经有多过20篇应用该技术的文章发表在顶级期刊如 Nature，Nature Medicine 以及 Nature Biotechnology 上, 将为肿瘤免疫学，神经生物学等重要转化医学课题带来革命性的创新。
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