T细胞分离阴选、阳选区别有多大？

1、细胞分选方式

细胞分选也称为细胞的分离纯化，是一种根据细胞所具有的特性把某种特定的细胞亚群从混合的细胞样本中分离出来的技术，在体外诊断、治疗和细胞学基础研究等方面均具有重要作用。根据细胞的免疫特性和理化性质，目前常见的细胞分选方式主要有以下三种：

（1）免疫磁珠分选：基于细胞表面抗原能与连接有特异性抗体磁珠结合的特性，在外加磁场作用下，细胞通过与磁珠上偶联的抗体特异性识别而被吸附，在磁场中停留，从而达到细胞分离的目的。

图1 ：免疫磁珠分选示意图

（2）流式细胞分选：通过不同的荧光素标记样本中的一种或多种细胞，再经由流式细胞仪区别不同细胞的相关参数（光散射和荧光特征），将不同细胞分离。

图2：流式细胞分选示意图

（3）密度梯度离心：用一定的介质在离心管内形成连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力的作用使细胞分层、分离。

图3：密度梯度离心示意图

其中，免疫磁珠分选由于其所需设备简单，对技术人员要求不高，分选所得的细胞通量大、灵敏度高、纯度好且细胞活性和复苏率较好，对于下游应用影响较小而被广泛应用。

2、细胞分选在细胞治疗中的重要性

细胞疗法是近些年医药研发中发展非常迅速的一个领域，是药物开发一种全新的模式，它在癌症、传染病和自身免疫等疾病的治疗方面展示出了巨大的潜力。并且，随着国内外政策的放行与大力支持，免疫细胞治疗相关的各项临床研究在全球相继开展，细胞治疗的相关企业也随之兴起。尽管近几年细胞治疗产品的细胞来源和种类不断丰富，但针对T细胞进行改造的细胞疗法目前仍占据整个细胞治疗领域的主导位置。

图4 ：临床试验中的各种类型的细胞疗法

T细胞的有效分选能够减少病毒的用量，提高转导效率，节省成本。另外有研究显示，T细胞分选能直接影响到CAR-T细胞的抗肿瘤活性，关系到后续T细胞的激活和扩增，是CAR-T终产品质量的保证。

3、细胞分离阴选和阳选的区别

免疫磁珠细胞分选根据所标记细胞的不同大致可分为阳性分选（正选）和阴性分选（负选）：

阳选（正选）：通常是指对目的细胞进行标记，使其滞留在磁场中，直接获得目的细胞。阳性选择是最广泛验证、灵活有效的方法，理论上来讲只要有目的明确的细胞表面标记物，我们都可以用细胞阳性选择的方法识别抓取，在非常极端的情况下，比如非常稀的细胞、弱表达的细胞表面标记物、充分彻底去除特定细胞群都应考虑阳性分选。

阴选（负选）：通常是指对非目的细胞进行标记和去除得到目的细胞。避免通过直接地标记目的细胞（比如使用表面特异性抗体标记），从而来减少细胞活化的可能。

4、T细胞分离阴选和阳选的选择

在免疫防御中，T细胞有着不可替代的作用。在过去十多年时间里，T细胞治疗在临床试验中突飞猛进，取得了前所未有的突破。目前T细胞主要的分选策略有两种：一是以纳米级别磁珠为基础的分选，主要策略包括有CD4/CD8的分选或CD3的分选，而后联合使用纳米级别CD3/CD28激活试剂；二是以微米级别磁珠直接偶联CD3/CD28抗体对T细胞进行分选及激活。

而如何选择T细胞的分选方式，阴选还是阳选，表征Marker的确定，这就取决于具体的下游应用和生产工艺的考量。在选择合适的分选方式时，应该慎重考量下游研究应用是否必须使用未标记的细胞，与细胞表面蛋白结合的磁珠或者抗体是否会影响下游的应用等因素。此外，获得的目的细胞的纯度、活率和回收率是否符合工艺要求，也是选择分选方式需要考量的地方。

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