- 原文：Proposal of Roseburia faecis sp. nov., Roseburia hominis sp. nov. and Roseburia inulinivorans sp. nov., based on isolates from human faeces
- 作者：Sylvia H. Duncan1, Rustam I. Aminov1, Karen P. Scott1, Petra Louis1, Thaddeus B. Stanton2, Harry J. Flint1 Hide
- 作者单位:
- Gut Health Division, Rowett Research Institute, Greenburn Road, Bucksburn, Aberdeen AB21 9SB, UK
-
National Animal Disease Center, USDA ARS, PO Box 70, 2300 Dayton Road, Ames, IA 50010, USA
image.png
摘要：
- 七个最近培养的细菌分离株，尽管其16S rRNA基因序列与小肠罗氏菌Roseburia intestinalis L1-82T（DSM 14610T）相似，但它们并没有充分相关，无法包含在现有物种中，从而在16S rRNA基因系统树中形成了三个单独的簇。 从人粪便中分离出的分离物是革兰氏可变的或革兰氏阴性的，严格厌氧的，轻微弯曲的杆状菌。 所有菌株的细胞测量值约为0.5×1.5-5.0μm，并且能够运动。 属于一个簇的两个菌株（A2-181和A2-183T）是唯一能够在甘油上生长并且无法在任何测试的复杂底物（菊粉，木聚糖和支链淀粉）上生长的菌株。 属于第二个簇（由M6 / 1和M72 / 1T代表）的菌株在山梨糖醇上的生长能力不同于其他分离株。 属于第三个簇的分离株（L1-83和A2-194T）是唯一无法在木糖上生长且在菊粉上生长良好的菌株（M6 / 1和M72 / 1T菌株生长较弱）。 所有菌株均为净乙酸盐利用者。 代表性的Roseburia菌株A2-183T，A2-194T，M72 / 1T和肠小肠鼠L1-82T的DNA G + C含量分别为47.4、41.4、42.0和42.6 andmol％。 基于16S rRNA基因序列相似性，提出了三种新的Roseburia属物种 。 Roseburia hominis sp. nov. (type strain A2-183T=DSM 16839T=NCIMB 14029T), Roseburia inulinivorans sp. nov. (type strain A2-194T=DSM 16841T=NCIMB 14030T) ,Roseburia faecis sp. nov. (type strain M72/1T=DSM 16840T=NCIMB 14031T).）。
- 从人类粪便样品中分离出以丁酸盐为主要产品的严格厌氧菌。 以前发现人类粪便中的大多数丁酸盐生产者属于两个主要类别，即梭菌簇IV（Duncan等，2002b）和簇XIVa（Hold等，2003； Barcenilla等，2000）。 在后一组中特别流行的是与Roseburia相关的细菌。 先前提出了基于人粪便分离物的肠道Roseburia菌（Duncan et al.,2002a），并且本论文的目的是提出三种新颖的Roseburia菌属。
- 从健康婴儿和四个健康成年人的最高可稀释粪便样本中分离出产生丁酸的菌株。 获得Grampian Research Ethics Committee 的道德批准（项目号00/00133）。 如前所述（Louis等，2004），从厌氧M2GSC培养基（Miyazaki等，1997）或设计用于选择类硒单胞菌的培养基的离心管中进行分离。 使用无氧二氧化碳准备好所有培养基并进行厌氧维护。 分离株可通过在7.5 ml等分试样的M2GSC培养基中在37 C下生长16–18 h进行常规维护。
- 按照Ausubel等人的方法，从在M2GSC培养基上生长的24小时培养物中提取DNA并进行纯化。 使用通用引物组扩增16S rRNA基因（Weisburg等，1991）。 PCR条件如Wood等所述。 （1998）。 16S rRNA基因序列的在线相似性分析是通过NCBI和EMBL的blast程序以及核糖体数据库计划（Maidak等，2001）进行的。 使用clustal_x程序将核苷酸序列与参考16S rRNA基因序列进行比对（Thompson等，1997）。 系统发育分析使用phylip软件包（Felsenstein，1989）中的邻接法（Saitou＆Nei，1987）和最大似然法（Felsenstein＆Churchill，1996）进行，并且使用paup软件包进行简约分析（Swofford，2002）。 通过自举分析（Felsenstein，1989）对树枝进行统计验证，在邻居加入法和简约法中涉及1000棵重采样树，在最大似然分析中涉及100棵树。
- 图F1显示了基于16S rRNA基因序列的系统进化树，涉及13个分离株，分别来自三个个体。 来自两个个体的六种分离株序列与肠道小肠球菌成簇。 然而，其余的七个序列与识别的物种并不对应，而是落入了树中的三个簇中（图1F1）。 没有一个分离株与最初从小鼠肠中分离出来的R. cecicola（Stanton＆Savage，1983）足够接近，无法包含在该物种中。 基于它们的系统发育位置和表标株特征（下文报道），我们建议三个簇中的每一个代表一个新物种，其中A2-183T，M72 / 1T和A2-194T为代表标株菌株。 16S rRNA基因序列比较的矩阵显示，菌株A2-183T，M72 / 1T和A2-194T分别与肠道小肠结肠杆菌L1-82T具有97.3％，95.4％和92.7％的序列相似性。 菌株A2-183T和M72 / 1T彼此具有95.4％的相似性，与菌株A2-194T具有93％的相似性。 用A2-183T和M72 / 1T聚类的菌株与相关菌株的相似性> 97％。 然而，菌株L1-83与菌株A2-194T具有95.5％的相似性。
- DNA G + C含量的测定采用高效液相色谱法（德国DSMZ）（Tamaoka＆Komagata，1984； Mesbah等，1989）。 代表性菌株A2-183T，A2-194T和M72 / 1T的值分别为47.4、41.4和42.0 mol％。 用相同的方法在此确定用于比较的肠杆菌R1-82T的G + C含量为42.6 mol％。
- 如Holdeman等人所述，在37°C的M2GSC培养基上对指数和固定相培养物进行革兰氏染色后，在Olympus BX50光学显微镜下以×1000的放大倍数观察所有分离物的细胞形态。 （1977）。
- 在37°C的滚管中的复杂生长培养基上孵育培养物48°h之后，三个代表性菌株（A2-183T，M72 / 1T和A2-194T）的单菌落很小（直径为1-3mm）。 乳白色，半透明，整个边缘。 此处研究的所有13个菌株均为革兰氏可变，微弯曲的杆，且均为运动标株。 先前已证明肠小肠鼠R1-82T具有运动能力，这是由于位于亚末端的多个鞭毛的存在（Duncan等，2002a），菌株A2-183T也具有多个鞭毛束（图2F2）。 所有代表性菌株均无法在4或20°C下生长，在30°C下均表现出较弱的生长，而在37°C下则表现出最佳生长。
- 通过在预先还原的琼脂平板表面上铺展晚期指数培养物并将平板暴露于空气中不同时间，测试了八种菌株对氧气的耐受性。 在最少暴露时间2分钟后，肠杆菌R1-82T，L1-952和L1-8151以及菌株A2-181，A2-183T，M6 / 1，M72 / 1T和A2-194T均无法生长， 而保留在手套箱中的控制板（在80％的氮气，10％的二氧化碳和10％的氢气的气氛中）生长良好，存活数约为108 cfu ml-1（数据未显示）。
- 通过向YCFA培养基中添加终浓度为0.5％的储备液（10％，w / v）的过滤灭菌糖溶液来确定底物利用率（Duncan等，2002b），将其以7.5ml的量分配到Hungate管中。 在本研究中，添加碳源的YCFA培养基为瘤胃培养提供了一种方便的替代瘤胃液培养基的方法。 用分光光度法测量生长，以650 nm处的吸光度为单位。
- 测试了代表肠道小肠结肠菌的11个菌株（5个菌株）和其他3个与Roseburia相关的簇的生长能力，它们在液体培养基中的一系列碳水化合物底物上生长（表1T1）。 仅肠杆菌，菌株A2-181和A2-183T能够以阿拉伯糖作为唯一添加的能量来源生长。 与cececola一样，以肠球菌为簇的菌株以及包含菌株L1-83和A2-194T的第二簇能够以蔗糖为能源生长（弱）。 测试的其他菌株属于另外两个不同的簇，未能在蔗糖上生长。 与R. cecicola相同，但与其他三种Roseburia物种相反，菌株A2-181和A2-183T能够与甘油一起生长。 与cececola共同的两个菌株M6 / 1和M72 / 1T在山梨糖醇上生长。
- 先前的观察结果显示，与Roseburia相关的菌株利用人类饮食中存在的多糖的能力存在差异（Duncan等，2003）。 如表1T1中所总结的，只有菌株M6 / 1，M72 / 1T，A2-194T和L1-83能够以菊粉（大丽花）为底物生长。 特别是肠道燕麦菌株，以燕麦杂种木聚糖为底物生长良好，而菌株M6 / 1和M72 / 1T在该底物上生长较弱。 淀粉的利用十分普遍，只有两个菌株（A2-181和A2-183T）不能以支链淀粉（来自马铃薯淀粉； Fluka）为底物生长良好。 当在37°C的M2GSC培养基上生长24h，并利用乙酸盐（表2T2）时，所有与玫瑰菊属相关的菌株均形成丁酸酯作为主要的发酵产物。 除两个菌株（L1-83和A2-194T）形成的丁酸低于7.3μmM且使用最低浓度的乙酸盐外，所有菌株均形成14至24μmM的丁酸。 所有菌株形成甲酸盐和乳酸盐。 属于一个簇的两个菌株（A2-181和A2-183T）具有最高的G + C含量（47.4％mol％），并且与小肠鼠R1-82T具有97％的序列相似性。 这些是唯一不能在所有测试的复杂碳水化合物底物（菊粉，木聚糖和支链淀粉）上生长的菌株。 属于第二簇（M6 / 1和M72 / 1T）的菌株与菌株A2-181和A2-183T在山梨糖醇和支链淀粉上的生长能力不同。 属于第三个簇的分离株（L1-83和A2-194T）与小肠念珠菌L1-82T具有大约93％的序列相似性，此外，这是唯一在菊粉上具有良好生长的菌株（菌株M6 / 1和M72 / 1T） 增长乏力）。 Roseburia属的最新描述包括R. intestinalis和R. cecicola，后者是类标株种。 属的描述可用于以下提出的三个新物种。
Duncan等修订了对Roseburia intestinalis 的描述。 2002年 该描述由Duncan等人给出。 （2002a）。 L1-82T标株菌株的DNA的G + C含量为42.6 4mol％。
Roseburia hominis sp. 的描述
- Roseburia hominis（人类的hom.i'nis。L. gen。hominis，指人类肠道栖息地）。 细胞可通过革兰氏变异到革兰氏阴性，稍弯曲的杆状，并通过多个鞭毛运动。 细胞的大小约为0.5×1.5-5μm。 最佳生长温度为37°C。 严格厌氧。 M2GSC琼脂在37 C的温度下生长良好，孵育48 h后形成乳白色的半透明菌落，边缘完整，直径约1-3mm。 化学有机营养的。 利用阿拉伯糖，果糖，葡萄糖，麦芽糖，纤维二糖，木糖和甘油作为生长的能源。 以棉子糖或蜜三糖为能源，生长缓慢/不发生。 蔗糖，山梨糖醇，燕麦拼木聚糖，支链淀粉和菊粉（大丽花）未用于生长。 丁酸盐和甲酸盐是主要产物，乳酸盐是葡萄糖的次要产物（0.2％），培养基中存在乙酸盐的净消耗量。 过氧化氢酶阴性。 该标株的DNA的G + C含量为47.4 mol％。 隔绝与人的粪便在阿伯丁，苏格兰。 标株是A2-183T（= DSM 16839T = NCIMB 14029T）。
Roseburia inulinivorans sp. 的描述
- Roseburia inulinivorans（in.ul'in.i'vor.ans。NL n。菊粉，菊粉； L。part。adj。vorans，吞噬； NL part。aulin。菊粉，吞噬，指将菊粉用作 生长基质）。 细胞是革兰氏可变的，可以是革兰氏阴性，活动的，微弯曲的杆。 细胞的大小约为0.5×1.5-5μm。 最佳生长温度为37°C。 严格厌氧。 M2GSC琼脂在37°C的条件下生长良好，孵育48°h后形成乳白色的半透明菌落，边缘完整，直径约1-3mm。 化学有机营养的。 利用果糖，葡萄糖，麦芽糖，纤维二糖，菊粉（大丽花）和支链淀粉作为生长的能源。 蔗糖或蜜三糖为能源会导致生长缓慢。 阿拉伯糖，棉子糖，木糖，甘油，山梨糖醇和燕麦拼木聚糖不用于生长。 葡萄糖生成丁酸盐，甲酸盐和一些乳酸盐，培养基中存在乙酸盐的净消耗量。 过氧化氢酶阴性。 该标株的DNA的G + C含量为41.4 mol％。 隔绝与人的粪便在阿伯丁，苏格兰。 标株是A2-194T（= DSM 16841T = NCIMB 14030T）。
Roseburia faecis sp. 的描述
- 粪源罗氏菌Roseburia faecis（fas'cis。L. gen。n。faecis指粪便来源）。 革兰氏易变，运动，略弯曲的杆。 细胞的大小约为0.5×1.5-5μm。 最佳生长温度为37°C。 严格厌氧。 M2GSC琼脂在37 C的温度下生长良好，孵育48 h后形成乳白色的半透明菌落，边缘完整，直径约1-3mm。 化学有机营养的。 利用果糖，葡萄糖，麦芽糖，纤维二糖，棉子糖，木糖，山梨糖醇，蜜二糖和支链淀粉作为生长的能源。 菊粉或燕麦拼成木聚糖为能源会导致生长缓慢。 阿拉伯糖，蔗糖和甘油不用于生长。 丁酸盐和甲酸盐是主要产物，乳酸盐是葡萄糖的次要产物（0.2％），培养基中存在乙酸盐的净消耗量。 过氧化氢酶阴性。 该标株的DNA的G + C含量为42.0 mol％。 隔绝与人的粪便在阿伯丁，苏格兰。 类标株应变为M72 / 1T（= DSM 16840T = NCIMB 14031T）。 在本研究中确定的Roseburia菌菌株的16S rRNA基因序列的GenBank / EMBL / DDBJ登录号在图1F1中给出。
图1
- 基于Roseburia相关菌株的16S rRNA基因序列，采用最大似然法构建的系统树。 在系统发育重建中使用了1150个明确的核苷酸位置；
-
分析中省略了带有缺口的位置。 节点上方的数字是从100个引导树生成的置信度。 丛生真杆菌的16S rRNA基因序列被用作外群。GenBank登录号在括号中给出。
image.png
图2
Roseburia hominis sp。的扫描电子显微照片。 A2-183T，showing a flagellar bundle. Bar, 1 μm.
image.png
表1
通过与没有添加碳水化合物的对照相比，在具有0.5％（w / v）底物的液体培养物中测试了属于Roseburia属的菌株对底物的利用。 所有菌株对于纤维二糖，果糖，麦芽糖和葡萄糖的发酵都是阳性的。 24 h时的ΔOD650值：+，> 0.4，w，> 0.15和<0.4。 对于ce.cola，+表示培养液pH值明显降低。 −，负数； nr，未记录。
image.png
L1-81，L1-93，L1-952，L1-8151和L1-82T。
†A2-181和A2-183T。
‡M6 / 1和M72 / 1T。
§L1-83和A2-194T。
||来自Stanton＆Savage（1983）的数据基于最终培养物pH值而非光密度的测量；该菌株已不存在，无法与较新的菌株直接比较。
表2
Roseburia菌株在M2GSC培养基n上形成和利用的短链脂肪酸（mM）的范围，研究的菌株数。
image.png
`