CRISPR/Cas系统介绍

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas)9 系统成功被改造为第三代人工核酸内切酶，与锌指核酸内切酶(zinc finger endonuclease，ZFN)和类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-likeeffector nuclease，TALEN)一样可用于各种复杂基因组的编辑。该技术成功应用于人类细胞、斑马鱼和小鼠以及细菌的基因组精确修饰，修饰类型包括基因定点改造、多位点同时改造等。由于其突变效率高、制作简单及成本低的特点，被认为是一种具有广阔应用前景的基因组定点改造分子工具。

对于CRISPR/Cas 的作用机理可以分为三个阶段来理解，第一是CRISPR 的高度可变的间隔区的获得，第二是CRIPSR 基因座的表达(包括转录和转录后的成熟加工)，第三是CRISPR/Cas 系统活性的发挥或者是对外源遗传物质的干扰。

CRISPR 的高度可变的间隔区(spacer)获得，其实就是指外来入侵的噬菌体或是质粒DNA 的一小段DNA 序列被整合到宿主菌的基因组，整合的位置位于CRRSPR 的5' 端的两个重复序列之间(repeats)．因此，CRISPR 基因座中的间隔序列从5' 到3' 的排列也记录了外源遗传物质入侵的时间顺序．噬菌体或是质粒上与间隔序列对应的序列被称为protospacer，通常protospacer 的5' 或是3' 端延伸几个碱基序列很保守， 被称为PAM(protospacer adjacent motifs)，它的长度一般为2～5碱基，一般与protospacer 相隔1～4 碱基．新间隔序列的获得可能分为三步：首先识别入侵的核酸和扫描外源DNA 潜在的PAM，将临近PAM 的序列作为候选protospacer；然后在CRISPR 基因座的5' 端合成重复序列；最后新的间隔序列整合到两个重复序列之间．目前只有第一个步骤被证实，Cas1 和Cas2 蛋白是负责新间隔序列获得的核心蛋白．另外研究发现TypeⅡ CRISRP/ Cas 系统中Csn2 蛋白对于新的间隔序列的获得也是必需的。

CRISPR 获得新间隔序列示意图

CRISPR 基因座首先被转录成前体CRISPR RNA(pre-crRNA)，然后在Cas 蛋白或是核酸内切酶的作用下被剪切成一些小的RNA 单元，这些小RNA 即为成熟crRNA，由一个间隔序列和部分重复序列组成，TypeⅡ型CRISPR/Cas系统crRNA 的成熟除了需要Cas9 和RNaseⅢ参与以外，还需要tracrRNA 的指导．CRISPR 基因座在没有受到外界压力的情况下表达水平很低．当外源的质粒或是噬菌体入侵宿主菌时CRISPR 的表达很快被诱导上调。

干扰是CRISPR/Cas 发挥抵御外源遗传物质入侵最关键的步骤，成熟的crRNA 与特异的Cas 蛋白形成核糖核蛋白复合物，再与外源DNA 结合并扫描到外源DNA，寻找其上的靶序列，crRNA 的间隔序列与靶序列互补配对，外源DNA 在配对的特定位置被核糖核蛋白复合物切割．早期研究认为crRNA 的间隔序列(spacer)与外源DNA 的靶位点完全互补配对对于切割是必需的，但是后来的研究证明spacer 与protospacer 部分互补配对时切割也可以发生。

哺乳动物细胞中gRNA (chemricRNA) 介导Cas9 基因定点编辑