酵母的转化和克隆

酿酒酵母作为一种普遍用于遗传学和细胞生物学研究的简单真核模式生物，能有助于深入了解人类细胞进程。
这里主要记录：酵母细胞摄取外源DNA

质粒：是一种小分子的环状超螺旋DNA，因而非常容易通过细胞膜上的膜孔。

• 质粒带有一个能被限制性内切酶酶切的多克隆位点，由相同内切酶酶切的DNA片段，能够连接到酶切过的多克隆位点处。

  
  
  质粒的结构
• 质粒还含有确定开始复制质粒位置的 复制原点。
• 质粒还有 选择标记，能使含有该质粒的酵母细胞在特定环境下生长。未携带该质粒的酵母无法在选择培养基上生长。
  （这些选择标记可以是耐药性基因或者编码某氨基酸的基因，使得缺陷型酵母株系能合成该氨基酸）

1. 酵母载体

穿梭载体：是指能在多个不同宿主种属中内复制的载体，如既可在大肠杆菌中又可以在酵母中复制的载体。

1.1 酵母载体类型

酵母载体可以是非整合型也可以是整合型载体。质粒既可以整合到基因组DNA中，也可以独立存在。

载体类型

1.2 常用的酵母载体

通常用于酵母的质粒或载体有以下5种，最常用于转化酵母细胞的是酵母游离质粒YEp 和 酵母着丝粒质粒 YCp。

酵母载体

这两个质粒都含有自发复制序列ARS，自发复制序列含有复制原点，使之能在酵母体内独立于染色体进行复制。

穿梭质粒

2. 酵母转化的方法原理

目前有几种不同的方法用于酵母转化：原生质体法、电转和醋酸锂法，这里只介绍醋酸锂法。

醋酸锂法利用带有正电荷的锂离子中和细胞壁和质粒上的负电荷，转化混合物中的单链DNA将结合在细胞壁上，因而只剩质粒DNA能被酵母细胞摄取。

质粒DNA

然后利用突然增温，造成细胞内外压力差，在细胞壁上形成小孔让质粒进入。一旦温度降下来，酵母细胞壁恢复，转化即可完成。

细胞壁形成小孔

3. 酵母转化的实验步骤

3.1 准备感受态酵母细胞

先从琼脂平板挑取酵母细胞，然后用酵母膏-蛋白胨-葡萄糖培养基（YPD），一种酵母生长的完全培养基来扩增克隆。30摄氏度摇床或旋转器培养过夜。
离心酵母细胞，弃上清留沉淀，然后用相应的缓冲液或蒸馏水重悬。这样准备的感受态细胞将被用于转化。

3.2 配制“转化mix”

按照下图配比配制“转化mix”，试剂配制好后，置于30摄氏度摇床30min（混匀即可，不必大幅度震荡，以免酵母细胞破裂）

转化mix

细胞置于42摄氏度水浴热激15min，然后置于冰上冷却2min，离心收集细胞。细胞用双蒸水重悬后涂板在含有载体相应抗性的选择性培养基上。转化后的平板在30摄氏度继续培养2-4天，直到长出克隆。

注意增加 阳性对照 和 阴性对照：

• 阳性对照（证明转化后的细胞健康正常）：质粒DNA转化后的酵母细胞涂在无选择性的完全培养基，应该长出克隆
• 阴性对照（证明操作过程无污染）：未转化质粒的酵母细胞涂在相应选择性的培养基，不应该长出克隆

4. 酵母转化的应用

4.1 酵母杂交（双杂交）

应用目的：鉴定与诱饵蛋白相互作用的蛋白。
将来自候选结合蛋白文库的质粒转化酵母细胞，如果它编码的蛋白与诱饵蛋白有相互作用，就会释放转录因子，从而激活报告基因，如β-半乳糖甘酶。在含有β-半乳糖甘酶底物的平板上，报告基因会使含结合蛋白的阳性克隆变成蓝色。

酵母双杂交

4.2 多点缺失模型

利用性循环的技术手段在酵母中制造多点缺失。含报告基因和缺失位点的单倍体细胞通过随机分配和减数分裂重组的方式，整合成一个细胞。

单倍体重组

可以通过选择标记，筛选含有缺失的酵母细胞。

含有缺失的酵母细胞

酵母还可以转化荧光标记的蛋白，以观察突变对蛋白相互作用的影响。
eg: 采用荧光显微镜观察研究不同突变对在内吞中必须的蛋白间相互作用所造成的影响。