植物单细胞样本制备||玉米愈伤组织原生质体制备方法

实验步骤：

• 取1.5克悬浮培养的玉米愈伤组织，加入15ml的酶液（4% Cellulase RS Yakult, 1% Rhozyme in KMC salt solution）.在温控摇床上30度温育3-4小时。
• 先用100um的，然后再用50um的滤网对消化过的组织进行过滤。
• 过滤后的原生质体转移到12ml的离心管里，缓慢顺壁倒入1-2ml的蔗糖溶液（0.6Msucrose，0.5% MES，pH6.0），使蔗糖溶液在原生质体下方形层。离心60-100g 10mins。原生质体会在两相中间成环。
• 收集原生质体，13/14 KMC溶液进行冲洗（这里应该是指如收集的原生质体为1ml，则加入13ml的KMC），离心，加入6/7 KMC溶液清洗两次。
• 重悬原生质体于原生质体培养基中。
  KMC buffer : 8.65g/l KCl, 12.5 g/l CaCl2, 16.47 g/l MgSO4, 5g/l MES

Comment：

o 过于老旧，Rhozyme似乎已停产，找不到生产厂家。但查到其乃是一种hemicellulase，可以直接用其他hemicellulase（如Macerozyme R10）代替。
o 温育时间长，有3到4个小时。也没有提到摇床速度。可尝试50rpm，分别在1.5hr和2hr时进行镜检，检查细胞的解离速度。一旦产生足够单细胞即停止酶解，进行清洗。
o 目前蔗糖梯度对于基因表达的影响尚未知，可尝试用KMC直接进行清洗，去除蔗糖梯度离心成环步骤。
o 可用于单子叶植物，特别是禾本科愈伤组织的原生质制备。

方法来源：Shillito, et al., (1989). Regeneration of Fertile Plants from Protoplasts of Elite Inbread Maize. Nature Biotechnology, 7(6), 581–587. doi:10.1038/nbt0689-581

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