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研究背景：
糖基化是一种常见的蛋白质翻译后修饰，是乳腺癌(BC)肿瘤发生和进展的关键事件。糖基转移酶的异常表达导致糖基化模式异常，在BC结果中具有诊断潜力。随着糖基学的发展，越来越多的证据证实了动态糖基化变化与肿瘤进展密切相关。这表明蛋白质糖基化是诊断和监测各种癌症的有前途的生物标志物。挖掘潜在的糖基化生物标志物及其表达变化对预测癌症的诊断、预后甚至治疗耐药具有重要意义。
研究结果：
一、共识聚类分析破译潜在的细胞生物效应糖基转移酶基因
1、这些氧化石墨烯富集项与糖基化、高尔基堆和转移糖基基团有关（图1A）。
2、KEGG分析还显示，糖基转移酶基因在O-聚糖、N-聚糖和糖鞘脂生物合成中富集，（图1B）。
二、糖基化标志的发展
1、Cox回归分析发现13个不同表达的糖基转移酶基因与BC预后相关(p < 0.05)(图1C)。
2、应用Lasso回归进一步缩小基因数量(图1D)。
3、最后，选取9个糖基转移酶基因(FUT7, ST3GAL1，根据TCGA训练集的1089例病例筛选ST3GAL3、ST6GALNAC4、B3GNT2、CHPF、POMGNT2、ALG3和STT3A，建立预后风险特征(图1 E)。
4、9个选定的糖基转移酶基因的表达特征见热图(图2A，B)。
5、在训练集风险特征相同的情况下，将验证集分为低风险组和高风险组。高危组预后较差，基因表达不同(图2B)。
6、KM生存曲线显示低危组明显延长OS、无病生存期、无进展间隔时间(p < 0.05)(图2C-F)。
三、糖基化标志的验证
1、基于TCGA数据集，单因素和多因素回归分析显示，风险评分与预后相关(p < 0.05)(图3A, B)。
2、为了直接有效地预测1年、3年和5年的生存概率，构建了一个包含风险评分和临床病理因素的诺模图(图3C)。
3、使用校正曲线对1-、3-、5年诺模图准确性进行校正，结果表明诺模图与实际生存率具有较高的一致性(图3D)。
4、此外，我们绘制了时间相关的ROC曲线来评估风险特征。2-、3-和的AUC值4年OS概率分别为0.702、0.733和0.743(图3 E)。
5、此外，风险评分的AUC值比年龄、分期和T、N、M期的预测能力高（图3F）。
四、风险模型比较
1、选择了5种现有的预后风险模型与本研究血糖特征进行比较，并绘制了5种模型的ROC曲线和KM曲线(图4A, C)。
2、该模型3年的AUC值高于5个模型的AUC值，并且该模型C指数最高(图4B)，表明我们的模型在六个预后风险模型中表现最好。
3、6个模型的HR和p值如图4D所示。
五、风险特征的临床相关性
1、热图显示临床病理因素和9个糖基转移酶基因的分布(图5)。
2、相应散点图进一步显示年龄(图5B)、生存状况(图5C)、临床分期(图5D)、T分期(图5E)、N分期(图5F)与危险评分相关，M期与危险评分无显著相关性(图5G)，结果采用Wilcoxon符号秩检验(p < 0.05)。
3、此外，7对基因与风险评分正向高度相关，2对基因与风险评分负相关(图5H, I)。
六、风险基因集富集分析与得分相关的信号通路
1、结果表明高危组卡侯氏体、DNA包装复合体、果糖和甘露糖代谢、类固醇生物合成和紧密连接丰富，免疫反应激活、适应性免疫反应、B细胞激活、哮喘、细胞因子-受体相互作用、造血细胞谱系、原发性免疫缺陷，然而T细胞受体信号通路在低风险组中富集较高(图6A, B)。
2、根据总基因(图6C)、糖基转移酶基因(图6D)和9个选定的标志性糖基转移酶基因(图6E)进行PCA分析。结果表明，选定的9个糖基转移酶基因在低危组和高危组的表达谱分化良好。
七、9个糖基转移酶基因分析中变异和拷贝号改变
1、对9个糖基转移酶基因进行了突变和CNA分析(图7A)。
2、9个糖基转移酶基因在乳腺浸润性导管癌、乳腺浸润性混合黏液癌、乳腺浸润性癌(NOS)和乳腺浸润性小叶癌中的突变和CNA频率如图7B所示，其中乳腺浸润性导管癌的突变频率最高。、
3、ST3GAL1的错义突变和截断突变定位在糖转移29区域(图7C)。
4、瀑布图显示，两组中前20个基因的突变频率存在显著差异(图7D, E)。
八、糖基化标志预测乳腺癌中免疫细胞渗透和响应化疗和靶向治疗
1、应用ssGSEA量化22个免疫细胞亚群和29个相关通路的富集分数比较两组免疫细胞的比例和相关通路的活性(图8A, B)。
2、相关分析表明，风险评分与免疫细胞比例呈负相关，与肿瘤突变负担(TMB)呈正相关(图8C, D)。
3、分析了BC中4个糖基转移酶基因的拷贝数变异(CNV)与免疫浸润水平的相关性，表明臂级缺失B3GNT2和其他一些糖基转移酶基因的CNVs与免疫浸润程度有关(图8E)。
4、ESTIMATE算法证实，在低危组中，ESTIMATE评分、基质评分、免疫评分显著升高，肿瘤纯度较低 (图 9A)。
5、功能障碍，肿瘤免疫功能障碍和排斥(TIDE)和微卫星不稳定性(MSI)，除排除外，低危组明显较高(图9B)。
6、TIDE高且风险评分较低的患者预后最好(图9C)。
7、此外，高危组BC患者TMB高于低危组，支持高危组BC患者中突变基因较多(图9D)。
8、RNA茎干性评分(RNAss)与风险评分相关，DNA茎干性评分(DNAss)也是如此(图9E)。
9、KM曲线显示IMvigor210队列中低风险评分的患者抗pd -1/PD-L1和抗CTLA -4治疗的预后更好(图9G)。
10、完全缓解(CR)/部分缓解(PR)组的风险评分低于稳定疾病(SD)/进展疾病(PD)组(图9H)。
11、免疫和肿瘤细胞PD-L1水平低的患者具有较高的风险评分，且高风险评分与沙漠免疫表型密切相关(图9I-K)。
12、SubMAP算法推测抗PD1和抗CTLA4应答性免疫治疗在BC患者高、低危险组的可能性。低危组对PD-1治疗的反应可能更好(bonferroni校正的p < 0.01)(图10A)。
13、低风险组七步得分高于高危组(图10B)。PD1、PDL-1和CTLA-4的表达水平与危险评分呈负相关(图10C)。
14、在低危组中，抗pd -1/PD-L1和抗CTLA-4治疗的相对可行性更高(图10D-G)。
15、为了评估标志物对化疗反应预测的有效性，计算每个病例中阿霉素、雷帕霉素、依泊苷和埃波西隆的估计IC50。结果发现高危组药敏更高(图10H)。
九、风险模型在外部临床队列和体外实验中的预测能力验证
1、用qRT-PCR检测的9个糖基转移酶基因表达水平计算20例患者的风险评分(图11A)。
2、将临床队列分为低危组和高危组。结果与先前的模型很一致。免疫组化结果显示STT3A在高危患者中过表达(图11B)。免疫荧光试验显示，低危组抗肿瘤M1巨噬细胞标志物升高，同时STT3A降低(图11C)。
3、沉默STT3A(图12A, B)，进行CCK-8分析，探讨STT3A在BC细胞增殖中的作用，结果显示STT3A沉默抑制了MCF-7和MDA-MB-231细胞的增殖(图12C, D)。
4、Transwell实验和伤口愈合显示STT3A沉默抑制了MCF-7和MDA-MB-231细胞的迁移(图12E-H)。
5、ConA、PHA-L和PHAE的表达强度显著升高表明高危组中N-聚糖的表达较高(图12I)。
6、STT3A的沉默显著降低了MCF-7和MDA-MB231细胞中N-聚糖的表达(图12J, K)。
总结：
综上所述，本研究成功构建了TCGA数据库中9个糖基转移酶基因的糖基标记。研究证实高危组预后较差，免疫抑制。此外，该糖蛋白标记与免疫细胞浸润、肿瘤免疫周期、对ICIs的反应性和BC的化疗敏感性密切相关。对BC患者糖基转移酶水平的综合评价有助于了解免疫浸润，指导更有效的免疫治疗策略。本研究的风险模型与金标准方法的结合将协同促进治疗BC的预后评估。