SnapGene简单入手(三)

“SnapGene是构建质粒的利器。”

        前面介绍了利用双酶切方法将目的基因连接到EGFP质粒中构建荧光质粒。但是双酶切方法有很多局限性，例如目的基因中不要有酶切位点；不同酶buffer不同；酶切后的电泳验证；步骤多周期长。

        TA克隆方法(Original TA Cloning Kit)是把PCR片段与一个具有3‘-T突出的载体DNA连接起来的方法。因为PCR反应中所使用的聚合酶具有末端转移的活性，PCR反应时在每条PCR扩增产物的3`端自动添加一个3`-A突出端。只有用经过特殊处理的具有3’-T突出末端的DNA片段才能通过T/A配对进行连接。但是TA克隆需要比较商业化的载体，最大的优势就是方便，不需要酶切位点可以将扩增产物直接连接到载体上。

这一部分以IL-6(白介素-6)为目的基因连接到pET-SUMO质粒中，然后进行大肠杆菌发酵表达目的产物。

1. pET-SUMO

2. 乳糖操纵子

        原核生物绝大多数的基因按功能相关性成簇地排列，且密集于染色体上共同形成一个转录单位——操纵子，也称基因表达的协同单位。E.coli的乳糖操纵子含Z、Y及A三个结构基因，分别编码β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)、通透酶(permease)和乙酰基转移酶(transacetylase)；此外还有调控基因：操纵序列O(operator)启动序列P(promoter)；而Lac inhibotor(编码Lac阻遏物，Lac repressor)不属于乳糖操纵子。

        lacZ、Y、A基因的转录是由lacI基因指令合成的阻遏蛋白所控制。lacI一般和结构基因相毗连，但它本身具有自己的启动子和终止子，成为独立的转录单位。由于lacI的产物是可溶性蛋白，按照理说是无需位于结构基因的附近。它是能够分散到各处或结合到分散的DNA位点上。就像上面质粒图谱中的LacI元件，LacI基因表达生成Lac阻遏蛋白会结合到lac operator上阻止了后续基因和插入目的基因的表达。

        在这个操纵子(元)体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞，经β-半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖——即生理上的诱导剂。半乳糖能够和LacI阻遏蛋白结合从而使得阻遏蛋白脱离操纵子，使得后续基因能够顺利表达，而在实验中，通常选用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂，IPTG是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。

        分解代谢物基因激活蛋白(catabolite gene activator protein，CAP)是细菌本身中有一种能与cAMP特异结合的蛋白，在与cAMP结合后能够发生空间构象变化而被活化，形成cAM-CAP复合物。CAP-cAMP能以二聚体的方式与CAP结合位(CAP binding site)结合，极大地增强RNA聚合酶的转录活性。

        rop：通过调节RNA I和RNA II的互作，降低pUC ori的复制，从而控制质粒的拷贝数，太高的拷贝数对蛋白表达有影响。

3. 引物和目的片段

首先还是在NCBI上面找到所需要的mRNA片段，然后设计引物反转录成cDNA。引物还是按照之前的使用snagene设计即可，注意到Tm温度，二聚体等事项即可。

4. TA克隆

按照之前的方法，将IL-6的序列导入到snapgene中，命名保存好。

然后在行动--TA或GC克隆中选择TA克隆

后续按照自己的需求选择所需要插入的T载体，并导入进去。这里以pET-SUMO为例介绍。

        这里注意一下，选择PCR模板即可，后面可以直接把引物也一块给出来，然后选好要插入的片段。选择产物的功能，然后选择引物即可完成。

全部设置好后点击克隆，即可完成整个设计

需要注意的是两端都加-A碱基，所以插入的时候方向性是蛋白能够成功表达非常关键的因素，牵扯到转录翻译的顺序，所以在挑选单克隆扩增之后，需要进行测序鉴定。

        特征里面，可以将你的目的片段自己进行标记，添加特征，方便以后查看修改和汇报等。

        最后一个TA克隆设计就完成了，图中还给了用来测目的片段序列的前后通用引物，在测序的时候直接选择即可方便很多。

        这只是前面最基础的设计部分，依靠软件即可完成，后续的鉴定，转化，IPTG诱导，表达，纯化等等都需要大量的学习才能顺利完成一个表达蛋白，希望这部分内容能对大家有所帮助。