DNA甲基化检测方法

为什么要检测 DNA 甲基化？首先，我们为什么要检测 DNA 甲基化呢？检测 DNA 甲基化能回答什么问题？我们都知道，DNA 甲基化可以调控基因表达，因此检测 DNA 甲基化至少可以为解释基因表达的调控提供一些线索。其次，DNA 甲基化参与一系列重要生物学过程，包括早期胚胎发育、基因组印记、X 染色体失活、重复序列的沉默以及癌症的发生发展转移，DNA 甲基化也有助于阐明这些重要的生命过程背后隐藏的奥秘。此外，DNA 甲基化一个非常重要的应用，是可以作为肿瘤的生物标志物。DNA 甲基化如此重要，我们可能需要时刻想着它。

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图 1. DNA 甲基化的几种应用场景所谓知己知彼，百战不殆，我们还得知道我们要检测的 DNA 甲基化在人基因组内的基本情况。人类大约有 30 亿个碱基对，DNA 主要发生在 CpG 二核苷酸上，基因组中大约有 2800 万个 CpG 位点。这些 CpG 位点中，大约 60~80% 被甲基化，而在一些特定的区域，比如启动子，存在 CpG 位点富集的序列，我们称之为 CpG 岛，CpG 岛通常未被甲基化。但是在肿瘤细胞中，整体甲基化水平降低至 20~50%，与正常细胞相比，即可能有 10~60% 的 CpG 位点的甲基化状态发生了改变，也就是大约 280~1680 万个 CpG 位点。

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图 2. 人类基因组中 DNA 甲基化概况

位点特异性的 DNA 甲基化刚才我们介绍了总体 DNA 甲基化水平的检测，但是这些方法都没有提供序列信息。如果我们需要知道位点特异性的甲基化信息，这个时候需要问第二个问题，我是只检测感兴趣的几个基因就行了，还是需要知道全基因组每一个基因的甲基化状态。如果我们只需要检测特定基因的 DNA 甲基化状态，紧接着，我们需要问第三个问题，我们只是定性地看看甲基化状态，还是定量地看甲基化的水平。

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图 13. 四个问题 2.0 版本之第二、三个问题Methylation-specific PCR，MSP如果只是定性地看甲基化的状态，最简单快捷的是甲基化特异性的 PCR。MSP 可以快速检测 CpG 岛中任意一组 CpG 位点的 DNA 甲基化状态。

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图 14. MSP 检测 DNA 甲基化的原理[6]（图片来源：https://www.mgmed.com/）首先抽提 DNA，进行重亚硫酸盐转化，未甲基化的 C 转变为 U，随后用两对引物进行 PCR，一对引物是甲基化特异性的引物，可以结合甲基化的 DNA，另一对可以特异性结合未甲基化的 DNA。如果一开始被甲基化了，那么利用甲基化特异性的引物可以扩增出来；如果一开始呈现未甲基化状态，那么使用特异性结合未甲基化的引物可以扩增出来；随后通过琼脂糖凝胶电泳即可检测。我们可以看到，这里最关键的是针对特定的区域设计两对 PCR 引物，我们可以借助 Methprimer 网站（http://www.urogene.org/methprimer/）设计甲基化的引物；MSP 最大的优势是，非常简单和快速，你只需要有一台 PCR 仪就可以进行了，但是最大的局限在于你每次可能只能检测一两个 CpG 位点。MethyLight当然，我们还可以选用基于荧光的方法，比如 MethyLight。比如在甲基化特异性的引物的 5’ 端偶联上 FAM 的荧光团，而在未甲基化特异性的引物的 5’ 端偶联上另一种荧光团 VIC，在 real-time PCR 过程中，会不断释放 FAM 和 VIC，通过检测 FAM 和 VIC，来鉴定甲基化的状态；通过测定 Ct 值，对甲基化进行定量。对于每个 PCR 反应而言，模板量小于 100 ng 重亚硫酸盐转化的 DNA。

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图 15. MethyLight 的工作原理（图片来源：QIAGEN, EpiTect MethyLight PCR Kit）Bisulfite cloning & SequencingMSP 和 MethyLight 都是简单快速的方法，都需要借助甲基化的引物。对于检测特定基因的甲基化，最常用的可能是重亚硫酸盐转化&克隆测序（Bisulfite cloning & Sequencing）。首先针对特定的区域设计引物，随后用限制性内切酶消化基因组DNA，接着用重亚硫酸盐处理，PCR，挑克隆测序。这里推荐一些引物设计过程中可能需要用到的软件或网址，包括如何寻找 CpG 岛，如何设计甲基化的引物等。通常，结果呈现是如图 16（右下）。

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图 16. 重亚硫酸盐转化&克隆测序[7]

基于高通量测序的全基因组 DNA 甲基化检测方法接下来，我们看一下第四个问题的另一种答案，我们用高通量测序来检测全基因组的 DNA 甲基化。之所以最后讲这个，是因为这个比较烧钱，而且后续的生物信息学分析比较复杂。WGBS & RRBS对于二代测序的方法，WGBS（Whole-Genome Bisulfite Sequencing）是目前的“金标准”。WGBS 想必大家都已经很熟悉了，但是考虑到 WGBS 成本较高，因此还有一种跟 WGBS 十分相似，但是只测基因组中的一部分的方法，即 RRBS（Reduced representation bisulfite sequencing）。

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图 21. WGBS & RRBS 的比较[10]两者的差别在于，WGBS 通常使用超声打断整个基因组，并对整个基因组进行重亚硫酸盐处理和测序；但是 RRBS 使用 MspI 限制性内切酶。RRBS 可以检测到人类基因组中 85% 的 CpG 岛。RRBS 大约需要 100ng-1ug 的 DNA，而对于 WGBS 而言，需要 50-100ng DNA。尽管 WGBS 被誉为检测 DNA 甲基化的“金标准”，但是依然存在很多的不足。首先，重亚硫酸盐必须转化未甲基化的 DNA，否则会造成假阳性，不过目前我们可以通过加入 spike-in 作为对照来克服这个问题；还有，目前测到的 DNA 甲基化是多个细胞的平均甲基化状态，单细胞的 DNA 甲基化检测可能克服这个问题；其次，重亚硫酸盐转化，会降低基因组的复杂度，造成后续的 mapping 率不高；重亚硫酸盐转化还可能造成 DNA 断裂，这使得扩增长片段比较困难。另外，WGBS 的成本还是非常高的。

参考资料：https://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzIxMjA0NzU0OA==&mid=2650983484&idx=1&sn=5386066548d8e218e5087ca2ff3e8554&scene=21#wechat_redirect