单细胞RNA系列专题之一：单细胞RNA测序中质控之重要细节 （下篇）

作者：赵玥
审稿：童蒙
编辑：angelica

引言

单细胞RNA测序是目前的一大热门。通过单细胞RNA测序，能够带给我们原来 bulk RNA 测序所得不到的信息，对于研究发育生物学，肿瘤生物学，免疫等有着极其重要的价值。

单细胞测序的核心就是t-SNE降维，以及聚类。那么在做这些工作之前的质控，关乎到整个分析的成败。这篇文章我就继续给大家讲讲单细胞质控的那些事儿。

单细胞分析整体流程

我们先来简单了解一下整个单细胞的流程：

整个单细胞分析的核心其实就是确定cell types/ lineages。而在此之前的一步就是数据质控(QC, quanlity control)。我们在得到表达矩阵之后，会做Data normalization , 基因集筛选，批次效应的去除等工作；之后用PCA， t-SNE进行降维。如果在这一过程中发现了一些问题，我们会移除掉一些细胞，然后重新质控，降维分析。

质控的检查点:

一般而言，检查点有如下一些：

• 唯一比对率
• 比对到外显子区域的比例
• 单细胞全长转录本中的3'偏好性
• 比对到mRNA上的reads
• UMI/reads比值
• 检测出的基因数目
• 检测Spike-in RNA
• 线粒体、核糖体RNA 比例

比对率比较低或者reads数较少有可能是建库原因。reads数较少可能与形成较多的primer dimer有关，而比对率低通常是建库的原因。

如果spike-in RNA序列很少，那么就可以直接说明是建库失败。如果spike-in 正常，但细胞RNA序列较少，可能是因为这个细胞本身就非常小，或者细胞在建库前出现了破损。

检测出基因的数量与细胞大小直接相关。如果检测出的基因（UMI）过多，很有可能是这个droplet里面有多个细胞，但是也不能排除是这个细胞就是非常的大。如下图，基因数目过多或者过少，都是不正常的情况。

通常而言，细胞大小、spike-in RNA比例与检测出的基因数往往是正相关的，如下图。

如果线粒体RNA过高，也同样预示着细胞有破损。因为当细胞破损时，细胞质RNA会跑出来，但是线粒体RNA由于有线粒体膜的包裹，不会溢出。因此，当细胞膜有破损时，线粒体RNA所占比例会很高。注意：当细胞出现apoptosis, necrosis的时候，也会有这种现象。

核糖体RNA占比较高时，可能是因为细胞内出现了较多的RNA降解。在全长单细胞转录组中，3’ 偏好性可用于检测细胞内是否存在大量RNA降解。

如何过滤细胞

1.使用指标

通常，大多数细胞都会有相同趋势，我们综合多个指标来去掉一些不合格的细胞。因此要先看一眼数据的分布，再决定有哪些细胞需要被过滤掉。

在上图中，我们对细胞中基因的数量、唯一比对率、基因body比对率、spike_detection等绘制分布图，然后剔除不合格细胞，将能够通过上述所有质控标准的细胞保留下来、用于后续分析。

2.基于PCA

基于PCA这一算法也可以进行质控，找到明显没有与其他细胞聚到一起的细胞。这些细胞被认为是质控不达标的细胞，如下图所示。

我们已经有了这么多方法和指标去过滤细胞，那么我们需要注意一些什么呢？

1. 你是否有很多细胞大小非常相近的同源的细胞？比如血红细胞。
2. 你在过滤细胞的时候要小心，因为你有可能会过滤掉一些占比不高的细胞类型。
3. 很多时候都是先做PCA/tSNE 之后再判断是否移除掉一些细胞，或者把之前移除掉的细胞重新加回来。然后再去做降维。就这样循环往复。

如何过滤基因

接下来就是要讨论如何过滤基因，对于绝大多数情况，我们不会用所有的基因去进行降维分析，所以需要进行基因集合的选取。

基因集的设定是基于：

（1）表达量高于一定阈值的基因
（2）在整个细胞样本中存在差异变化的基因
（3）用先验的知识去挑选基因
（4）bulk RNA测序中已经鉴定出来的差异基因。
（5）t-SNE降维时只选取前几个PC

有些时候，有些基因的表达异常高，这对后续数据的Normalization带来影响，有时也会考虑过滤掉。比如nulcear lncRNA ,、actin,、hemoglobin,、线粒体RNA和核糖体RNA。

有一些基因要根据情况需要进行移除，以下三点要根据课题情况来决定是否保留或者去除。

1. 线粒体RNA
2. 任何可能有偏好性的基因：细胞周期基因等
3. 对细胞分型可能没有帮助的基因：比如核糖体基因

批次效应的处理

单细胞RNA测序最棘手的就是批次效应（batch effect）。batch effects 可以发生在：

1. 不同的实验
2. 不同的动物/病人/细胞中
3. 测序的lane中

不同批次的样品或许采用的质控标准也应该不一样，通过PCA的结果，可以查看结果中是否有明显的批次效应。

总结

• 精心设计你的实验，你寻找的生物学信号不会被技术噪音干扰掉
• 小心地选择什么样的细胞和基因应当保留，什么应当移除掉
• 要小心鉴定含有多个细胞的droplet
• 做完降维和聚类后，重新进行QC统计