《生物信息学生R入门教程》读书笔记 Chapter 8

这一章讲述了上游分析

QC

1.barcode/adaptor的影响

人们常用的去除adaptor的软件有cutadapt、skewer等，但是近年来后起之秀TrimGalore因为其使用简单，会自动侦测adaptor而受到越来越多的欢迎。

原始的fastq文件往往是包含adaptor以及barcode的。如果不去除adaptor将会对下游的mapping产生影响。如果5'端存在adaptor的话，影响会非常严重。如果序列很短而3'端又存在adaptor的话，影响会较为严重。如果序列较长，影响会减弱，但终归是不利的影响

使用TrimGalore去除adaptor,单端

trim_galore -o output/folder input/fastq/file.fq.gz

双端

trim_galore --paired -o output/folder input/fastq/f_R1.fq.gz input/fastq/f_R2.fq.gz

mapping

所谓mapping，就是将测序得到的短序快速地比对至参考基因组

2.DNA-mapping

人们常用的mapping软件有BWA以及bowtie/2。如果对于比对精度优先的用户，多会使用BWA做为mapping软件。但是对于速度优先的用户，多会使用bowtie进行mapping
bowtie2

## single end
bowtie2 -x path/to/species/Sequence/Bowtie2Index/genome \
        -U fastq/trimmed/by/trim_galore/file_trimmed.fq.gz \
        -S output/sam/file.sam

## paired end
bowtie2 -x path/to/species/Sequence/Bowtie2Index/genome \
        -1 fastq/trimmed/by/trim_galore/file_val_1.fq.gz \
        -2 fastq/trimmed/by/trim_galore/file_val_2.fq.gz \
        -S output/sam/file.sam

BWA

## single end
bwa mem path/to/species/Sequence/BWAIndex/genome \
        fastq/trimmed/by/trim_galore/file_trimmed.fq.gz \
        > output/sam/file.sam

## paired end
bwa mem path/to/species/Sequence/BWAIndex/genome \
        fastq/trimmed/by/trim_galore/file_val_1.fq.gz \
        fastq/trimmed/by/trim_galore/file_val_2.fq.gz \
        > output/sam/file.sam

对于BWA，注意mem，backtrack和aln这三个参数：
mem：比对长度为100bp以上的序列时，效果好
backtrack：比对长度为100bp以下的序列时，效果好
aln：gap的数据（有缺失片段的）

2.RNA-seq

tophat

tophat --output-dir output/dir \
       --GTF path/to/species/Annotation/genome.gtf \
       path/to/species/Sequence/Bowtie2Index/genome \
       fastq/trimmed/by/trim_galore/file_trimmed.fq.gz

使用HISAT进行mapping

## single end
hisat2 -x path/to/species/hisat2/genome_snp_tran \
       -U fastq/trimmed/by/trim_galore/file_trimmed.fq.gz \
       > output/file.sam

## paired end
hisat2 -x path/to/species/hisat2/genome_snp_tran \
       -1 fastq/trimmed/by/trim_galore/file_val_1.fq.gz \
       -2 fastq/trimmed/by/trim_galore/file_val_2.fq.gz \
       > output/sam/file.sam

利用samtools排序

#sam文件转换成bam文件
samtools view file.sam > file.bam
#排序
samtools sort file.bam -o file.sort.bam
#建立索引方便查询
samtools index file.sort.bam

bam转bed

bamToBed -i reads.bam > reads.bed

picard去重

java -Xmx2048m -jar picard.jar CollectRnaSeqMetrics \
      I=input.bam \
      O=output.RNA_Metrics \
      REF_FLAT=ref_flat.txt \
      STRAND=SECOND_READ_TRANSCRIPTION_STRAND \
      RIBOSOMAL_INTERVALS=ribosomal.interval_list

Chip-seq peak calling

去除PCR duplicates

MarkDuplicates INPUT=file.sort.bam \
               OUTPUT=file.rmdup.bam \
               METRICS_FILE=fil.picard_info.txt \
               REMOVE_DUPLICATES=true \
               VALIDATION_STRINGENCY=LENIENT

peak calling

macs2 callpeak -t treatment.rmdup.bam \
               -c input.rmdup.bam \
               -f BAM -g hs -n output.sample1

数据查看

推荐IGV(Integrative Genome Viewer)
和UCSC genome browser