使用ASMap构建高密度遗传图谱

在我大学的时候，构建遗传图谱靠的是人工跑胶，然后看胶图统计基因型。当时我用的SSCP(单分子构象多态性)技术区分单个碱基存在差异的等位基因，要放在4度过夜12小时，然后第二天银染显色，放在一个医学看片的设备上读条带。

现在测序便宜了，简化基因组测序随随便便就能获得成千上万的分子标记。然而标记多有标记多的烦恼，就是以前的作图软件不好用了。以前的暴力穷举的方法在海量标记面前，几乎不可能在有限的时间里完成构图任务，而且更加麻烦的是高通量的SNP标记还容易出错。

R语言中有一些建图软件包，不过都有一些问题。qtl包的建图算法太老，onemap的算法是SERIATION, RECORD, RCD, UG, 但是代码不是C/C++写的，所以运行速度太让人着急。

在2017年，出现了一个新的R包，ASMap，它其实就是将MSTmap移植到了R语言中。MSTmap是很久之前就提出的高通量作图方法，只不过需要编译，有点不太友好。

ASMap支持如下群体:

BC: 回交群体
DH: 双单倍体群体
ARIL: 高世代重组近交系, 理论上是已经纯合的遗传群体(除了部分剩余杂合位点), 属于永久性群体
RILn: 低世代重组近交系，n=2时，就是F2群体。

算法说明简分为两个部分:

聚类算法: 如果分子标记和来自于两个不同的连锁群，那么, 并且标记间的加权距离(hamming distance)为。根据定义，MSTmap使用Hoeffding不等式确定标记是否来自于同一个连锁群
标记排序: 先根据遗传距离对标记进行分箱，也就是将共分离的标记当做一个对象。之后排序问题就视作 TSP(旅行商问题), 也就是寻找所有标记间最短的路径。

可用函数

图谱构建函数: 一共有两个，注意p.value的调整

mstmap.data.frame()
mstmap.cross(): 从qtl包的对象进行转换，对于高世代的RIL群体，要用conver2riself转换类型, 对于BCnFn群体要用conver2bcsft转换类型

标记调整函数:

pullCross(): 抽取异常分子标记
pushCross(): 检查完毕后，将符合要求的标记放回原处
pp.init(): 调整偏分离的阈值

可视化诊断:

profileGen(): 统计基因型中交换数，双交换数，缺失情况。适用于对遗传图谱质量进行评估
profileMark: 统计标记的偏分离，缺失比例，等位基因分布，双交换数
heatMap(): 以标记间RF(重组率)绘制热图

使用案例

内容翻译自: R Package ASMap: Effcient Genetic Linkage Map Construction and Diagnosis

第一步: 环境准备

加载环境和数据，其中数据集为300个群体，3023个标记的回交群体

library("qtl")
library("ASMap")
data("mapBCu")
summary(mapBCu)

如果是自己的数据集，有两种方法可以构建，一种是用mstmap.cross 转换qtl包中read.cross得到的对象，如下

mapthis <- read.cross("csv", "http://www.rqtl.org/tutorials", "mapthis.csv",
                      estimate.map=FALSE)
mapthis <- convert2bcsft(mapthis, BC.gen = 0, F.gen = 2, estimate.map = FALSE)
mapthis <- mstmap.cross(mapthis, id = "id")

或者用mstmap.data.frame, 要调整如下的参数:

object: 数据框, 行对应的标记名, 列是每个个体对应的基因型. 注, 构建数据框时，一定要保证字符串不能被当做是因子(stringsAsFactors=FALSE)。
pop.type: 群体类型，“BH","BC", "RILn"(低世代的近交系,RIL2可以认为是F2), "ARIL"(高世代的近交系)
dist.fun: 计算遗传距离的函数, 默认是"kosambi", 不需要更改。
p.value: 和群体大小有关，群体越大，p值要越小，也就是要更严格。

对于低世代的近交系，亲本基因型编码为"A"或"a", "B"或"b", 杂合基因型编码为"X". 所谓的缺失值编码为"U"或"-"

mstmap.data.frame这一步运行会比较慢，这是由于它会预先对数据进行分箱，减少标记量，提高后续的运算效率。

运行案例

第二步: 预处理

在正式构建遗传图谱之间，我们需要谨慎的按照如下清单检查我们用于构图的基因型/分子标记的质量，包括但不限于

检查每个个体对应的标记缺失比例，以及每个标记在所有个体中的缺失失比例。缺失比例过高说明标记或个体存在问题
检查群体间是否存在标记高度相似的两个个体。
检查过度偏分离(segregation distortion)的标记。高度偏分离的标记可能不会定位到唯一的座位上。
检查交换等位基因的标记。这些标记在构建图谱期间，难以聚类，或者和其他标记有关联，因此需要在分析前修复他们的匹配。
检查共分离的标记。共分离的标记会严重影响构图时的计算效率，所以可以先暂时把它们忽略掉。

检查每个个体的基因型缺失情况

plot.missing(mapBcu)

缺失分布

水平的黑线表示一些个体中，大部分的标记都没有对应的基因型，因此我们将这些个体移除。

sg <- statGen(mapBCu, bychr=FALSE, stat.type = "miss")
mapBC1 <- subset(mapBCu, ind=sg$miss < 1600)

从图谱构建的角度来看，高度相关的个体会增强标记的偏分离. 因此对于基因型几乎一模一样的个体，最好在建立图谱前移除

gc <- genClones(mapBC1, tol=0.95)
gc$cgd

从R返回的结果中，可以发现有将近11组的基因型几乎一样。但是第一组的BC045和BC039由于存在大量的基因型缺失，不足以说明两者相同，同样情况的还有BC052和BC045,以及BC168和BC045, 可以排除这三项。

cgd <- gc$cgd[-c(1,4,5)]
mapBC2 <- fixClones(mapBC1, cgd, consensus = TRUE)

接下来，可以进一步检查特定位点的观测等位基因频率和期望频率的偏差。这有可能是基因型考察错误，也有可能意味着该区域受到潜在的生物学和遗传学机制影响。这一步，同时检查分子标记的偏分离情况，不同基因型的占比，和缺失率。

profileMark(mapBC2, stat.type = c("seg.dist", "prop","miss"),
            crit.val = "bonf", layout = c(1,4), type="l")

基因型总体情况

对于高度的偏分离的标记，我们应该直接忽略掉

mm <- statMark(mapBC2, stat.type = "marker")$marker$AB
dm <- markernames(mapBC2)[(mm > 0.98) | (mm < 0.2)]
mapBC3 <- drop.markers(mapBC2, dm)

而对于不偏分离不怎么严重的标记，最好的方法是先把他们放在一边，等图谱构建完成之后再把它们放回到遗传图谱中。

pp <- pp.init(miss.thresh = 0.1, seg.thresh = "bonf")
mapBC3 <- pullCross(mapBC3, type = "missing", pars=pp)
mapBC3 <- pullCross(mapBC3, type="seg.distortion", pars=pp)
mapBC3 <- pullCross(mapBC3, type="co.located")

第三步: 构图

构图通常不是一次性完成的工作，需要多次迭代。先进行第一次尝试，运行时间取决于计算机性能和标记数目

mapBC4 <- mstmap(mapBC3, bychr = FALSE, trace = TRUE, p.value = 1e-12)
chrlen(mapBC4) #每个连锁群的长度

对构建出图谱进行可视化检查

heatMap(mapBC4, lmax = 70)

热图

热图分为两个部分看。上三角展示的是标记间的重组率，下三角则是标记间的LOD值，两者模式要是一样，那就说明图谱还是靠谱的。中间的正方形为连锁不平衡区(LD block), 一般在连锁不平衡区极少发生交换，而不同的连锁不平衡区交换频繁。

但是光看热图还是不够的，我们还得保证遗传图谱里个体的交换次数不应该太多。也就是，每个个体能发生的交换是有限的，比如说如果染色体长度为200cM，那么在回交后代中，每个个体的重组次数应该不多于14次。

水稻每条染色体平均0.5~1次交换。人类每次减数分裂平均30次。

pg <- profileGen(mapBC4, bychr = FALSE, stat.type = c("xo", "dxo", "miss"),
                 id="Genotype", xo.lambda = 14, layout=c(1,3),lty=2)

交换数分析

从上图可以发现，一些个体的重组次数明显过高，而且这些个体的双交换次数明显多于其他个体，缺失率也是如此。

我们需要将这些个体剔除，对遗传图谱进行升级

mapBC5 <- subsetCross(mapBC4, ind = !pg$xo.lambda)
mapBC6 <- mstmap(mapBC5, bychr = TRUE, trace = TRUE, p.value = 1e-12)
chrlen(mapBC6)

和上次相比，每个连锁群的长度明显减少，一般而言遗传图谱越小，图谱越可靠。

profileMark(mapBC6, stat.type = c("seg.dist", "prop", "dxo", "recomb"),
            layout = c(1, 5), type = "l")

交换数分析

最后结果表明，每个个体的双交换次数都没有超过1 个。

第四步: 加入前提剔除的标记

对于前期放在一边的标记，可以在图谱构建完成后放回到完成的图谱中，同时要仔细的检查。

先将515个缺失率在10%~20%的标记塞到图谱上。这一步是将当前的标记和图谱上的标记计算重组率，选择最近位置插入。然后展示长度明显小于其他连锁群的4个连锁群，判断是否能够将他们进行合并。

pp <- pp.init(miss.thresh = 0.22, max.rf = 0.3)
mapBC6 <- pushCross(mapBC6, type = "missing", pars = pp)
heatMap(mapBC6, chr = c("L.3", "L.5", "L.8", "L.9"), lmax = 70)

热图诊断

从图中，我们可以发现，L.3和L.5之间有明显的连锁，L8和L.9有明显的连锁。我们使用mergeCross()将这两个连锁群进行合并，这个时候的mstmap要保证bychr=TRUE, 对不同的连锁群分别计算标记距离，而不是从聚类开始。

mlist <- list("L.3" = c("L.3", "L.5"), "L.8" = c("L.8", "L.9"))
mapBC6 <- mergeCross(mapBC6, merge = mlist)
names(mapBC6$geno) <- paste("L.", 1:7, sep = "")
mapBC7 <- mstmap(mapBC6, bychr = TRUE, trace = TRUE, p.value = 2)
chrlen(mapBC7)

这样子就得到了更加优化的图谱。但是L1, L2, L.4的连锁群距离有一些轻微的提高，说明可能存在过多的交换现象

pg1 <- profileGen(mapBC7, bychr = FALSE, stat.type = c("xo", "dxo","miss"), 
                  id = "Genotype", xo.lambda = 14, layout = c(1,3), lty = 2)

交换分析

我们发现新引入的部分个体是导致该现象的元凶，这就需要我们将这些株系次移除掉，然后重建图谱

mapBC8 <- subsetCross(mapBC7, ind=!pg1$xo.lambda)
mapBC9 <- mstmap(mapBC8, bychr = TRUE, trace = TRUE, p.value = 2)
chrlen(mapBC9)

移除的株系不会对连锁群的数目造成影响，连锁图谱只会在组内进行重建。大部分连锁群的长度都有了一定程度的下降。继续观察一下标记的遗传图谱的表现情况

profileMark(mapBC9, stat.type = c("seg.dist", "prop"), layout = c(1, 5),
            type = "l")

频率变化

从图中可以发现，在L.2里面有一个诡异的突起(偏分离), 需要被移除。当然我们也能看到在L.3, L.5, L.7中，新增的缺失率10%~20%的标记，有一定程度的偏分离。剩下的295个标记为"seg.distortion"的标记说不定能解释这个情况，所以下一步就是把它们塞回去

sm <- statMark(mapBC9, chr = "L.2", stat.type = "marker")
dm <- markernames(mapBC9, "L.2")[sm$marker$neglog10P > 6]
mapBC10 <- drop.markers(mapBC9, dm)
pp <- pp.init(seg.ratio = "70:30")
mapBC11 <- pushCross(mapBC10, type = "seg.distortion", pars = pp)
mapBC12 <- mstmap(mapBC11, bychr = TRUE, trace = TRUE, p.value = 2)
round(chrlen(mapBC12) - chrlen(mapBC9), 5)
nmar(mapBC12) - nmar(mapBC10)

最后一步就是加入共分离的标记

mapBC <- pushCross(mapBC12, type = "co.located")

最后结果如下

结果统计