心肌病相关学术概念：
- 扩张型心脏病（DCM）：是一种普遍的心肌疾病，每250个人中便有1个病例，其特征是左心室(LV)扩张，心肌细胞减少并伴随纤维化，如此便导致心脏收缩能力受损。
- 心律失常性心机病（ACM）：同样会引起心室功能障碍，通常伴随心律失常和纤维脂肪堆积，表现明显的右心室(RV)受累。
这两种疾病都可能是由遗传原因引起的。
文献链接：Pathogenic variants damage cell composition and single cell transcription in cardiomyopathies | Science
假设不同基因的致病突变会引起不同的单细胞分子表型，为了解决这一问题，作者使用单核RNA测序(snRNAseq)对晚期DCM和ACM患者的心脏与非衰竭供体（对照）心脏相比，研究了心力衰竭发病的分子机制。
1. 实验设计
1.1 临床研究队列
- 对照组：18例健康人的左心室和右心室组织
- 患病组：61例心肌病患者的左心室和右心室组织（常见PVs-38例；非常见PVs-15例；PVs-PVneg-8例）
取样部位： 全厚左心室游离壁、心尖、间隔和右心室游离壁
1.2 分析分组
| 疾病类型 | 分组 | 致病突变情况 | 样本数量 |
|---|---|---|---|
| DCM | group 1 | LMNA | 12 |
| DCM | group 2 | RMB20 | 8 |
| DCM | group 3 | TTN | 12 |
| DCM | group 4 | PVneg | 8 |
| ACM | group 5 | PKP2 | 6 |
其他队列入组信息(图2A)：
- 研究队列中有15种基因型（PLN, BAG3, DES, FLNC,FKTN, TNNC1, TNNT2, TMP1, DSP）由于数量较少，在后续分析中被排除（除非有提示）
- 研究队列中男性居多（患病组60%; 对照组72%），作者也有基于性别的比对分析，但是差异不太显著，因而没有在正文内详细描述
- 患者平均年龄48岁
其他临床信息：
- LMNA、TTN和PVneg患者左室功能障碍相似
- RBM20患者左室扩张更大，收缩力降低
- PKP2患者，右心室功能降低
- LMNA、TTN的患者比其他组接受了更多的起搏器或再同步化治疗
2. 细胞异质性分析
- LV和RV样本的对比分析：解释了DCM和ACM的细胞类型和组成状态，分子信号表达和细胞间通讯的差异
- 疾病组与对照组的对比分析：通过细胞类型，细胞组成，基因表达差异解析患病机制
2.1 单细胞核转录组数据整合分析
（1）整合分析的细胞核数：患病组（500k）；健康组（380k）
（2）中值UMI区间：[1000-6000]umi/nuclei （图2B）
（3）聚类鉴定出10种主要的cluster：心室心肌细胞(CMs)、成纤维细胞(FBs)、脂肪细胞(ADs)、周皮细胞和平滑肌细胞(壁细胞、MCs)、内皮细胞(ECs)、免疫细胞（髓系和淋巴细胞）、神经元(NCs)和肥大细胞，细分的话又可以分为71种不同的细胞转录状态。（图2C）
2.2 疾病基因型相关的细胞类型比例变化
（1）左心室的细胞类群分析：除LMNA基因型之外，其余分析组与对照相比，均表现出心肌细胞减少；除PKP2基因型之外，其余分析组均表现出内皮细胞和免疫细胞增加（图3 A&B）
（2）右心室的细胞类群分析：除TTN基因型之外，其余分析组与对照相比，均出现心肌细胞减少；内皮细胞仅在LMNA，TTN，RBM20中显著增加；免疫细胞并没有太大变化（图3 C&D）
（3）由于成纤维细胞并没有在LVs和RVs的患病组中显著增加，因而组织病理学所表现的纤维化并不是增殖产生的
2.2.1 心肌细胞
心肌细胞亚群细分：
（1）将心肌细胞划分为以下几种状态：vCM1.0、vCM1.1、vCM1.2、vCM1.3、vCM2、vCM3.0、vCM3.1、vCM4、vCM5（图4 A）不同基因型间的vCM状态：
（2）不同vCM状态在不同基因型间的分布差异反映了血流动力学的差异，PVs组中vCM1.1和vCM1.2普遍较高（图4 B）不同基因型间的DEG分析：
（3）PVneg组的MYH6表达降低（MYH7:MYH6比例升高）（图4 C）
（4）PVs组的心肌细胞亚群中SMYD1基因表达显著下调（编码一种心脏保护性-肌肉特异性-组蛋白甲基转移酶）（图4 D&E）
SMYD1表达异常，会对心肌功能产生严重的影响，是心肌病患者早期临床表现的主要诱因，通常具有较差的预后
（5）个别分析组（PKP2）的心肌细胞亚群中FNIP2基因表达显著上调（抑制AMP活化蛋白激酶的激活和氧化代谢）（图4 F）
2.2.2 成纤维细胞
- 成纤维细胞亚群细分：
（1）将成纤维细胞划分为以下几种状态：vFB1.0、vFB1.1、vFB1.2、vFB2、vFB3、vFB4（图5 A） - 不同基因型间的vFB状态：
（2）vFB2在疾病组占比普遍高；vFB3在对照组占比普遍高（图5 B）
（3）vFB2显著高表达促纤维化基因如IL11，TGFβ靶点（图5 D），并促使疾病组TGFβ活性显著高于对照组中（图5 C）
（4）vFB3显著高表达促炎细胞因子基因CCL2以及OSM信号通路相关基因（图5 E） - 不同基因型间的DEG分析：
（5）个别分析组（LMNA,TTN,PKP2）EGFR显著高表达（图5 F）
（6）5个疾病组可以看到TGFβ2（促进纤维化）高表达（图5 G）
（7）DCM疾病组（LMNA,TTN,RBM20,PVneg）存在PCOLCE2高表达，促进不溶性胶原蛋白的形成；LMNA、TTN和PVneg下调了金属蛋白酶抑制剂TIMP1和TIMP3的表达（图5 H）
（8）胶原蛋白基因表现出基因型特异性表达（图5 I）
2.2.3 周皮细胞，平滑肌细胞
- 亚群细分：
（1）周皮细胞分为3种状态（PC1、PC2和PC3）；平滑肌细胞分为3种状态（SMC1.1、SMC1.2和SMC2）（图6 A）
（2）所有的周皮细胞中：心肌疾病组诱发信号导致细胞外基质重塑，表现为钠通道SCN3A表达上调，ADAMTS9-AS2上调，ADAMTS9下调（图6 B）
（3）PC1下调2个重要的中央信号受体（NOTCH3，PDGFRB），其中NOTCH3是SMC成熟所必需的，缺乏会导致周细胞功能障碍和动静脉畸形；Notch信号调节PDGFRB，而PDGFRB是血管生成和PC募集所必需的（图6 B）
（4）SMC1.2显著高表达ITGA8（维持SMC的收缩表型）和ATP10A（提示血管僵硬和舒张功能障碍增加）（图6 B）
（5）SMC2表达了高水平的参与胶原蛋白和弹性纤维形成的基因(ELN和LAMA2)和MYH10（图6 B） - 不同基因型间的DEG分析：
（6）对于基因型LMNA和PKP2，其SMC2均上调了SLIT3（高表达将刺激成纤维细胞活性），且促进细胞外基质重塑和胶原蛋白形成的相关通路基因显著富集（图6 B&C）
图6. 周皮细胞&平滑肌细胞在对照组、DCM、ACM中的状态：图A. 所有组织中的周细胞、平滑肌细胞UMAP分群图；图B. 不同细胞亚型的差异表达分析气泡图：横坐标表示差异表达的基因，纵坐标表示不同基因型，气泡的颜色表示在各基因型间差异表达的foldchange值，气泡的大小表示差异显著性；图C. SMC2亚类细胞的KEGG通路富集分析热图：横坐标表示不同基因型，纵坐标表示富集的通路，颜色深浅表示富集的显著性；
2.2.4 内皮细胞
- 内皮细胞亚群细分：
（1）内皮细胞分为7种状态：EC1、EC2、EC5、EC6、EC7、EC8、Meso（图7A） - 不同基因型间的ECs状态：
（2）疾病组的EC5丰度显著高于对照组（图7B）
（3）基因型特异性疾病组EC1丰度显著低于EC2、EC5和EC6（图7C） - 不同基因型间的DEG分析：
（4）EC7在所有的基因型特异性疾病组中具有最多的DEGs，在个别基因型中高表达编码参与心肌应激适应(NRG1)、CM心力产生(EDN1)和心内膜扩张(BMP6）的分泌蛋白（图7D）
（5）BMP6在DCM LVs和ACM RVs的心内膜中被选择性上调（图7E）
2.2.5 髓系细胞
- 髓系细胞亚群细分：
（1）髓系细胞分为14个亚群：巨噬细胞(MPs)、单核细胞(MOs)、常规树突状细胞(cDC1和cDC2)和增殖型髓系细胞等（图8A） - 不同基因型间的髓系细胞丰度差异：
（2）疾病组相比较对照组显著降低了增殖型髓系细胞的丰度，预示着其中存在单核细胞浸润（图8B）
（3）LYVE1hi/MHCIIlo 和 LYVE1lo/MHCIIhi MPs是组织中丰度最高的髓系细胞类型（图8C） - 不同基因型间的DEG分析：
（4）在抗原呈递的MPs中，RBM20（lv）基于MHCII基因的抗原呈递率最高（图8D）
2.2.6 淋巴细胞
- 淋巴细胞亚群细分：
（1）淋巴细胞分为15个亚群：8种T细胞，3种自然杀伤细胞（NK），先天淋巴样细胞(ILCs)、B细胞、浆细胞和增殖淋巴样细胞（图9A） - 不同基因型间的淋巴细胞丰度差异：
（2）与对照和ACM样本相比，DCM样本中存在CD4T(act)细胞显著增加（图9B） - 不同基因型间的DEG分析：
（3）PKP2基因型存在明显的淋巴细胞活化和成熟：细胞因子IFNG、CCL3、CCL4和信号分子CBLB、FYN和TXNIP，以及与淋巴细胞成熟相关的CD69、CXCR4表面受体在PKP2的多种淋巴细胞（NK细胞，CD4+T细胞，CD8+T细胞）中显著高表达（图9C）
CD4+辅助T细胞是心肌病和心肌炎发病机制的关键驱动因素
（4）LMNA基因型的CD4T(act)存在显著的TBX21表达上调（促使Th1极化）（图9D）
（5）与其他分析组不同的是，PVneg组的Th2极化因子GATA3显著下调（图9D）
2.2.7 神经细胞
- 神经细胞亚群细分：
（1）神经细胞分为8个亚群：NC1.0，NC1.1，NC1.2，NC1.3，NC2，NC3，NC4，NC5（图10A）
（2）NC1.1的特点是NFATC2的上调量最高（图10B）
（3）NC1.2的特点是心电间隔相关基因高表达，同时IGFBP5（参与神经元凋亡和自噬）与KCNK1（离子通道和心率调节因子）高表达（图10B&D）
（4）NC1.3高表达神经调节剂受体GALR1和磷酸二酯酶PDE10A和PDE3B，它们参与神经保护和信号转导（图10B） - 不同基因型间的NCs状态：
（5）NC1.1在LMNA和TNN的LVs显著富集（图10C）
（6）NC1.2在TNN和RBM20的LVs显著富集，在LMNA，TTN，PKP2的RVs显著富集（图10C）
2.2.8 脂肪细胞
- 脂肪细胞亚群细分：
（1）脂肪细胞分为4个亚群：AD1.0，AD1.1，AD2，AD3（图11A）
（2）经典AD1.0亚群：脂质代谢基因高表达（图11B&C）
（3）AD1.1亚群：DGAT2（编码一种甘油三酯的酶）和G0S2， MGLL（编码脂解调节因子）低表达；ABHD5（阳性脂解调节剂），PDK4（一种促进葡萄糖向脂肪酸代谢转变的激酶）和CIDEA（一种调节脂肪组织能量消耗的调节器）显著高表达（图11B&C）
（3）基质AD2亚群：ECM基因高表达（图11B）
（4）免疫AD3亚群：OSMR和细胞因子应答基因高表达（图11B） - 不同基因型间的ECs状态：
（5）疾病组中几乎没有免疫AD3亚群（图11D）
（6）AD1.1亚群几乎只在疾病组中高表达（图11E） - 不同基因型间的DEG分析：
（7）临床中普遍存在纤维脂肪变性的PKP2 RVs，DEG富集分析时显示在凋亡和细胞死亡通路高表达（图11F）
图11. 脂肪细胞在对照组、DCM、ACM中的状态：图A. 所有组织的脂肪细胞UMAP分群图；图B&C.气泡图显示脂肪细胞的marker基因：气泡大小表示细胞比例，颜色深浅表示平均表达量；图D.LV和RV中对照和其他基因型的脂肪细胞状态分布图：横坐标为总细胞百分比，纵坐标为不同基因型；E. 左右心室的AD1.0与AD1.1在不同基因型间的丰度分析：AD1.0在疾病组低水平富集，AD1.1在疾病组高水平富集；图F.疾病组相比对照组高表达基因的富集分析热图
2.3 GWAS基因在心肌病中的差异表达分析
全基因组关联分析（Genome wide association study，GWAS）是对多个个体在全基因组范围的遗传变异（标记）多态性进行检测，获得基因型，进而将基因型与可观测的性状(即表型)，进行群体水平的统计学分析，根据统计量或显著性 p 值筛选出最有可能影响该性状的遗传变异（标记），挖掘与性状变异相关的基因。
GWAS基因的细胞特异性表达变化可能会提高对其生物学效应的解释
（1）多个基因表现出细胞类型特异性表达，尤其在心肌细胞（CMs）中 ，如下ALPK3,BAG3, FHOD3, FLNC, HSPB7, MLIP, SLC6A6,SMARCB1, SVIL, TTN基因显著高表达（图12）
（2）热休克蛋白HSBP7在TTN LVs 和 LMNA，PKP2 RVs表达降低（图12）
（3）SLC6A6是一种具有心脏保护作用的牛磺酸和氨基酸转运体，除PKP2和PVneg两个分析组外，所有基因型的左心室和右心室样本中均有增加（图12）
（4）CDKN1A是一种细胞周期调节因子和凋亡调节因子，在LMNA组LVs的心肌细胞（CMs）中增加，而在RVs中没有增加（图12）
（5）MTSS1作为一个在不同细胞类型中广泛高表达的GWAS基因，它编码一个假定的肌动蛋白-细胞骨架相互作用因子，不过其在髓系细胞中存在普遍的高表达（不同基因型之间的差异不大），同时在LMNA组中的周皮细胞，成纤维细胞中表达增加，预示着对心肌细胞存在直接影响（图12）
（6）SLC39A8编码一种心脏溶质载体（基因表达普遍低），其在不同基因型的疾病组心肌细胞中表达没有显著差异，但却在LMNA和TTN的疾病患者内皮细胞中表达增加（图12）
3. 预测cell-cell相互作用
通过检测编码受体和配体的基因的表达，可以推断细胞间的信号传导和通信
- 汇总在所有（疾病）基因型中检测到的异常细胞间信号：（图13A）
（1）BMP,FNI,COLLAGEN,EGF,IGF,TGF等促进纤维化的通路普遍上调
（2）VEGF,NOTCH,ANGPT等与血管重构相关的通路普遍上调 - 在各基因型中特异性表达的信号通路：（图13B）
（3）LMNA：EDN
（4）TTN：促炎反应IL6
（5）RBM20：代表TNF信号通路的 BAFF/LIGHT
（6）PKP2：促炎性CCL和TNF
（7）PVneg：免疫调节模块BTLA - 细胞间相互作用的异质性分析：（图13C）
（8）IGF信号通路：对于细胞生长和心肌细胞（CM）肥大性生长至关重要，在不同基因型之间表现出成纤维细胞（FB）的自分泌调控和成纤维细胞（FB）到心肌细胞（CM）的旁分泌异质性；且从髓系细胞到心肌细胞（CM）的IGF信号只发生在TTN, PKP2, PVneg3种基因型中（或许会促进肌肉修复）
（9）NRG信号通路(包括NRG1-3和ERBB受体）：心肌细胞（CM）的自分泌调控在所有疾病中显著减弱（与对照组对比），同时，内皮细胞（EC）到心肌细胞（CM）的作用信号除RBM20外在其他基因型中显著增强
4. 基因型特异性表达模式识别
作者使用机器学习的算法graph attention network(GAT)，基于4种主要的左心室细胞（心肌细胞，成纤维细胞，内皮细胞，髓系细胞）的多项转录表达模式，对待测数据的基因型进行分类，能够准确预测基因型如LMNA, TTN, RBM20, PKP2和PVneg。
（1）GAT的预测准确性因细胞类型而异：心肌细胞（0.93）> 成纤维细胞（0.92）> 髓系细胞（0.85）>内皮细胞（0.79）(图13D-上半部)
（2）4种细胞类型的预测结果整合进一步提高了基因型预测的准确性，最终可以获得一个高置信模型(图13D-下半部)
5. 讨论和总结
（1）尽管研究对象为不同患者心脏（接受的治疗手段各不相同），但在同种基因型的PVs中检测到一致的基因表达谱，而不同基因型之间差异明显
（2）转录表达谱在不同细胞类型中差异多样化，这是bulk RNAseq水平不能揭示的
（3）尽管DCM和ACM在解剖学和组织病理学上存在差异，但是研究发现其心室组织的细胞组成是相似的，而且DCM LV与ACM RV极其相似
（4）心肌病患者与健康人相比，其心室组织中的心肌细胞显著减少，而内皮细胞和免疫细胞比例均有增加；同时成纤维细胞的比例并没有增加，只不过心室组织中增强了细胞外间质的基因表达并促进胶原沉积（造成了解剖学和病理组织学中纤维化的“假象”）
（5）基于细胞因子表达谱的差异，作者预测了细胞间相互作用模型，并找到一些关键分子（可以用于后续的机制研究），将我们观察到的差异表达与患者心脏组织中不良心脏重塑的表型建立因果联系
（6）心肌病患者中的心肌细胞表现出vCM1.0比例偏低，同时心肌细胞亚群在不同基因型患者之间存在DEGs，它们大多与应激诱导的收缩、代谢和一些电生理特性相关，而这些特性正是对应基因型患者的显著临床表现
（7）不同基因中的pv诱发细胞类型和状态特异性反应，改变细胞间通信并促进不同的疾病途径