三代ONT甲基化相关分析软件

一、deepmod

1、三代测序得到的fast5文件是muti fast5，一个fast5文件里面有4000条fast5序列，deepmod不支持muti fast5，需要拆分成singal fast5. 使用ont官方的程序ont_fast5_api进行转换

https://github.com/nanoporetech/ont_fast5_api

$ multi_to_single_fast5 --input_path fast5 --save_path single_fast5 --recursive

2、需要使用Albacore对fast5文件进行basecalling，写入events文件

1）Albacore可以用docker来运行，https://hub.docker.com/r/robegan21/albacore

软件提供的训练集是用albacore2.3.1完成的，我们也用这个版本进行basecalling

2）read_fast5_basecaller.py -l 来查看不同的试剂盒和芯片对应的config文件，我的芯片是FLO-MIN106，试剂盒是SQK-109，对应的config文件是r94_450bps_linear.cfg

$ docker run -it --rm -v $PWD:/data robegan21/albacore:2.3.1 bash

$ read_fast5_basecaller.py -i single_fast5 -f FLO-MIN106 -k SQK-109 -r -t 10 -c /opt/albacore/r94_450bps_linear.cfg -o fast5,fastq -s albacore

3、Deepmod进行m6A检测

1）Deepmod安装参照官网，

https://github.com/WGLab/DeepMod/blob/master/docs/Install.md

tensorflow、matplotlib直接使用conda安装可能会出问题，建议安装时指定版本，按照安装说明中的版本，tensorflow安装1.7.0，matplotlib安装2.1.2

2）github上下载Deepmod，这个软件是免安装的，下载下来，只要上面的依赖都安装好了，就可以直接用

$ python Deepmod/bin/Deepmod.py detect --wrkBase albacore/workspace/pass --Ref ref/wt.fasta --Base A --FileID wt --modfile Deepmod/train_mod/rnn_conmodA_P100wd21_f7ne1u0_4/mod_train_conmodA_P100wd21_f3ne1u0 --threads 10 --outFolder wt

如果报错的话，加上 --basecall_1d Basecall_1D_001 再试一下

二、mCaller

1、安装参照说明即可，没有遇到什么问题
https://github.com/al-mcintyre/mCaller

2、multi fast5 转成single fast5
https://github.com/nanoporetech/ont_fast5_api

$ multi_to_single_fast5 --input_path fast5 --save_path single_fast5 –recursive

3、输入文件需要带event信息的fast5文件和对应的fastq文件，我们原始的fast5是不带event信息的，需要重新进行basecalling。用Albacore或者guppy均可，albacore用上面deepmod里面说的docker程序运行，guppy的话可以下载安装，用guppy进行basecalling

$ guppy_basecaller -i single_fast5 -s single_fast5 -c dna_r9.4.1_450bps_fast.cfg --fast5_out on --num_callers 4 --cpu_threads_per_caller 3

### --fast5_out 默认是off，这里要选成on，这样就可以输出带event信息的fast5文件了

4、将basecalling得到的fastq文件合并，并建立索引

$ cat *.fastq >> wt.fastq
$ nanopolish index -d workspace -s sequencing_summary.txt wt.fastq

##  workspace 是guppy basecalling输出的带event信息的fast5文件的文件夹

5、后面就按部就班来就好了

$ bwa index wt.fasta

$ bwa mem -x ont2d -t 12 wt.fasta wt.fastq | samtools view -Sb - | samtools sort -T /tmp/wt.sorted -o wt.sorted.bam 

$ samtools index wt.sorted.bam

$ nanopolish eventalign -t 12 --scale-events -n -r wt.fastq -b wt.sorted.bam -g wt.fasta > wt.eventalign.tsv （不要丢掉wt.fasta后面的>）

$ mCaller.py -m A -r wt.fasta -d r94_model_NN_6_m6A.pkl -e wt.eventalign.tsv -f wt.fastq -b A  ( -m 参数可以指定motif，比对GATC，如果想要检测所有的A的话，直接-m A就好了)

然后会得到一个wt.eventalign.diffs.6 的文件，里面有每个A是否发生甲基化修饰的信息了。后面还可以通过调整阈值线来判断哪些是真的甲基化修饰

三、tombo

1、安装
https://github.com/nanoporetech/tombo

使用conda安装，没有问题

2、tombo不支持multi fast5，同样使用ont_fast5_api进行转换
https://github.com/nanoporetech/ont_fast5_api

$ multi_to_single_fast5 --input_path fast5 --save_path single_fast5 –recursive

3、resquiggle 必须使用single_fast5文件夹为输入文件夹

$ tombo resquiggle single_fast5 wt.fasta –processes 4 –num-most-common-errors 5

4、检测6mA。tombo检测碱基修饰有3种方式，推荐使用alternative model

$ tombo detect_modifications alternative_model --fast5-basedirs single_fast5 --alternate-bases 6mA --statistics-file-basename wt_6ma

1）--statistics-file 是指定输出文件的名字

2）--alternate-bases还支持CpG dam dcm检测

得到wt_6ma.6mA.tombo.stats，后续的motif分析以及作图都是基于这个文件。

motif检测

$ tombo text_output signif_sequence_context --statistics-filename wt_6ma.6mA.tombo.stats --genome-fasta wt.fasta --num-regions 1000 --num-bases 20

得到检测到甲基化的A的周围20bp的序列，使用MEME进行motif检测