全基因组关联分析GWAS结果批量整理方法

GWAS 结果批量整理

今天分享一个算法,主要是利用R语言对GWAS分析得到的结果进行批量整理,适用于批量筛选关键SNP位点与对应的基因或QTL,尤其是多个表型多个材料的批量分析。

GWAS(全基因组关联分析)是一种常用的遗传学研究方法,用于探索基因与表型之间的关联。它通过对大规模样本集合进行基因组广泛扫描,寻找与特定表型(如疾病、性状等)相关的遗传变异。

GWAS结果示例

通过GWAS分析后会得到一个储存显著SNP的结果文件,假设其命名为“组别.表型.模型.阈值.result.txt”,理论上会有很多个这种格式的文件,文件内容如下:

"INDEX" "SNP" "CHROM" "POS" "REF" "ALT" "Effect" "SE" "trait"
"1" "rs151515" 1 25554 "C" "A" -1.630526 0.39931444 6.688587e-06
"2" "rs32151" 1 72857 "T" "TAC" 0.734972 0.17574796 9.271553e-06

第二列是SNP的位点名称,最后一列是对应的P值,这两个信息非常关键。

整理思路与算法解释

首先,library(tidyverse)加载R包,代码流程均使用优雅的tidy框架。

library(tidyverse)

step1:原始数据整理

大致思路是先读取当前目录下的文件列表,然后依次循环执行计算过程,识别表型、模型、P值等参数,然后传递给筛选函数,并对符合条件的值进行标注,最后会将结果写出为一个csv文件,用于下一步的计算。

id_list <- list.files("./data/",pattern = "*.txt")
for (id in id_list){
file_name <- paste0("./",id)
  atom <- str_split(id,"[.]")
  
  # Group A  -----
  if (length(atom[[1]]) == 5){ 
    phe <- atom[[1]][1]
    way <- atom[[1]][2] %>% str_replace("Farm",""
    plast <- atom[[1]][3]
    # 特异性标注P值并将其装换为数字型
    if (plast == "1e-5"){plast <- 6}else{plast <- as.numeric(plast)}
    print(file_name)
    # 计算P值并筛选
    df <- read_delim(file_name,delim = " ",
                     col_types = cols(CHROM = col_character()))
    colnames(df)[9] <- way
    df %>% 
      mutate(log = round(-log10(!!sym(way)),1)) %>% 
      filter(log > plast) ->data
    # 转换染色体编号
    i <- 1
    new <- data.frame(matrix(ncol = 2))
    new <- new[-1,]
    for (x in c(1:7)){
      for (y in c("A","B","D")){
        chr <- paste0(x,y)
        # print(chr)
        new_add <- c(i,chr)
        new <- rbind(new,new_add)
        i <- i + 1
      }
    }
    colnames(new) <- c("CHROM","chr")
    # 替换染色体编号
    data %>% 
      left_join(new,by = "CHROM") ->data2
    data2$loc <- phe
    # 待标注的log值筛选
    data2$logwt <- ifelse(data2$log > 10,paste0('log=',data2$log,sep=""),NA)
    data2$MB <- data2$POS/1000000
    # 写出为中间结果
    write_csv(data2,paste0("./out/1_GWAS_Result_txt2csv/",phe,".",
                           way,".csv"))
  }
}

获取文件列表:

使用list.files()函数,查找目录中所有满足文件名模式为"*.txt"的文件,并将它们的文件名存储在id_list列表中。

遍历文件列表:

使用一个循环来遍历id_list中的每个文件名(变量名为id)。

文件名解析:

使用str_split()函数,将文件名(id)按照"."分割成多个部分,存储在atom中。

条件判断 (Group A):

检查atom中的部分数量是否为5,如果是,进入下一步。这个条件判断似乎是要筛选特定格式的文件名。

变量赋值:

从atom中获取不同部分的值,分别赋给phe、way和plast变量。 对way进行处理,将其中的"Farm"替换为空字符串。

特殊值处理:

将plast的值与字符串"1e-5"进行比较,如果相等,将plast设置为6,否则将其转换为数值类型。

数据读取与处理:

使用read_delim()函数读取文件内容,并指定列类型。数据将被读入名为df的数据框。 修改df的第9列名称为way。 使用mutate()函数,计算并添加新的"log"列,值为way列的负对数的舍入值。 使用filter()函数,筛选出"log"列大于plast的行,结果存储在名为data的数据框中。

染色体编号转换:

使用两个嵌套循环,生成一个新的数据框new,其中存储了染色体编号的对应关系。 生成的new数据框将被用于将染色体编号从数字格式转换为字符格式。

数据处理与替换:

使用left_join()函数,将之前筛选得到的data数据框与new数据框按照"CHROM"列进行连接,结果存储在data2中。 将data2中的"CHROM"列替换为之前提取的phe值。 根据条件,计算并添加"logwt"列和"MB"列。

结果输出:

使用write_csv()函数,将经过处理的data2数据框写入指定路径("./out/1_GWAS_Result_txt2csv/")下,以"phe.way.csv"的格式命名。

step2:计算变异位点类型

首先进行初始化,设置参数确定连续变异位点的评判标准,然后读取参考基因组,新建内存空间用于添加候选标记位点。

# 根据GWAS得到的显著性SNP,将其标注到参考基因组上对应位置(300kb内为连续,大于300kb为单标记)
### 数据导入与参数设置 ====================================================================
windows_near <- 300*1000 #默认300kb内为连续
# 连续位点的评判标准是任意两个相邻位点的距离小于windows_near
id_list <- list.files("./out/1_GWAS_Result_txt2csv/")
Ref <- read_csv("./data/Ref.csv",show_col_types = FALSE)
Ref_chr <- Ref

all_single <- list() #汇总单标记
all_near <- list() #汇总连续标记

对于每个文件都要进行循环操作,以下列举其中一个文件的计算思路:

file_name <- paste0("./out/1_GWAS_Result_txt2csv/",id)
  # loc <- substr(file_name,14,18)
  # job <- substr(file_name,10,26)
  atom <- str_split(id,"[.]")
  print(file_name)
  data <- read_csv(file_name,show_col_types = FALSE)
  loc <- data$loc[1] 
  job <- paste0(atom[[1]][1],"_",atom[[1]][2],"_",atom[[1]][3])
  way <- atom[[1]][3]

以下进行单标记位点的筛选:主要的思路是对每一个位点,计算其前后相邻位点的距离,针对开头和结尾进行特殊考虑,中间的位点识别其是否相邻距离小于阈值。

# 计算基因位置间距
data$longH <- NA
data$longQ <- NA
data$class <- NA
for (i in 2:nrow(data)){
  a <- data$POS[i]
  i <- i+1
  b <- data$POS[i]
  i <- i-2
  c <- data$POS[i]
  i <- i+1
  if(i == nrow(data)){
    data$class[i] <- "wei"
    break
  }
  if(a-c<0){
    data$class[i] <- "shou"
    next
  }
  if(b-a<0){
    data$class[i] <- "wei"
    next
  }
  data$longH[i] <- (b-a)
  data$longQ[i] <- (a-c)
}
data$class[1] <- "shou"

# 对距离进行区分,按照windows_near为区分阈值

for (i in 1:nrow(data)){
  if (is.na(data$longH[i]) | is.na(data$longQ[i])){
    next
  }
  if (data$longH[i]>windows_near & data$longQ[i]>windows_near){
    data$class[i] <- "single"
  }
}

找出了连续的标记位点后,需要将其进行整理,转换为数据框格式,第一列为物理位置,第二列为信息,第三列为染色体,第四列为表型区,方法如下:

# 单标记位置信息写入single
single <- data.frame(matrix(ncol = 4))
single <- single[-1,]
colnames(single) <- c("positon","info","chr","loc"
for (i in 1:nrow(data)){
  tem_class <- data$class[i]
  tem_add <- c(data$POS[i],data$ws[i],data$chr[i],data$loc[i])
  ifelse(tem_class == 'single',single <- rbind(single,tem_add),"1")
  ifelse(tem_class == 'shou',single <- rbind(single,tem_add),"2")
  ifelse(tem_class == 'wei',single <- rbind(single,tem_add),"3")
}
colnames(single) <- c("positon","info","chr","loc"

接下来进行连续型标记位点的查找筛选,首先初始化一个矩阵用于储存中间变量。

需要注意的是连续型位点有两个位置参数,分别代表这个连续区段的开始和结束,另外需要统计该区段内有多少的实际位点。

near <- data.frame(matrix(ncol = 5)) #初始化矩阵
near <- near[-1,]
colnames(near) <- c("p1","p2","info","chr","number"

然后按照染色体进行迭代,每个染色体分开计算,主要步骤如下:

for (x in c(1:7)){
  for (y in c("A","B","D")){
    chr_id <- paste0(x, y, sep="")
# 将x和y连接起来,形成染色体编号chr_id

foot <- 0
# 步长,用于迭代计算阅读框,初始化为0

for (i in which(data$chr == chr_id)) {
  # 遍历data中chr等于chr_id的索引(位点)

  if (sum(data$chr == chr_id) < 2) {
    next
    # 若某个染色体的位点数小于3则跳过当前循环
  }

  if (foot > 0) {
    foot <- foot - 1
    next
    # 如果foot变量大于0,说明两个位点存在跨越关系,将foot减1,然后跳过当前循环
  }

  n_pos_1 <- data$POS[i]
  # 获取当前位点的位置信息

  for (m in which(data$chr == chr_id)) {
    n_pos_2 <- data$POS[m]
    # 获取另一个位点的位置信息

    if (n_pos_2 - n_pos_1 < 0) {
      next
      # 后一个位点位置小于前一个位点时,跳过当前循环
    } else {
      if (n_pos_2 - n_pos_1 == 0) {
        next
        # 两个位点位置相等时,跳过当前循环
      } else {
        if (n_pos_2 - n_pos_1 < windows_near) {
          foot <- foot + 1
          # 任意两个位点距离小于预设窗口大小,增加foot的值,跨越一个位点

          if (is.na(data$class[i])) {
            data$class[i] <- "near"
            # 如果位点尚不属于特定类别,则将其标记为"near"
          }
        } else {
          if (foot > 10) {
            n_wn <- paste0(data$SNP[i], "-", data$SNP[m-1], ", [", foot, "], Find in ", job)
          } else {
            n_wn <- paste0(data$SNP[i], "-", data$SNP[m-1], ", Find in ", job)
          }
          # 构建一个文本信息n_wn,描述了位点之间的关系和发现位置

          n_add <- c(n_pos_1, data$POS[m-1], n_wn, data$chr[i], foot)
          # 将相关信息存储在n_add向量中

          if (is.na(data$class[i])) {
            data$class[i] <- "near"
          }
          # 如果位点尚不属于特定类别,则将其标记为"near"
          break
        }
      }
    }
  }

  if (length(data$POS[m-1]) > 0) {
    if (n_pos_1 != data$POS[m-1]) {
      near <- rbind(near, n_add)
      n_add <- c()
    }
  }
}
}}
colnames(near) <- c("p1","p2","info","chr","number")

主要是对位点数据进行迭代和处理,根据位点位置以及预设的窗口大小,识别和处理相邻的位点之间的关系,最终将处理后的信息存储在不同变量中。

删除重复数据

由于部分信息统计时出现重复折叠,因此通过下述代码对结果中重复信息进行过滤。

# 删除重复行
near_new <- data.frame(matrix(ncol =5)) 
near_new <- near_new[-1,]
for (i in 1:nrow(near)){
  if (!identical(near$p1[i],near$p2[i])){
    new_add <- c(near$p1[i],near$p2[i],near$info[i],near$chr[i],near$number[i])
    near_new <- rbind(near_new,new_add)
  }
}
colnames(near_new) <- c("p1","p2","info","chr","number"
near <- near_new

按染色体进行标注

连续型变异区段的标注方法:

for (i in 1:nrow(near)){
  if (identical(near$chr[i],"Chr")){
    my_a <- which.min(abs(as.numeric(near$p1[i]) - as.numeric(chr_1A$Start.1)))
    my_b <- which.min(abs(as.numeric(near$p2[i]) - as.numeric(chr_1A$Start.1)))
    chr_1A$out[my_a:my_b] <- near$info[i]
  }
}

单独型变异位点标注方法:

for (i in 1:nrow(single)){
  if (identical(single$chr[i],"1A")){
    index <- which.min(abs(as.numeric(single$positon[i]) - as.numeric(chr_1A$X3G.Start.1)))
    chr_1A$out[index] <- single$info[i]
    OK <- OK+1
  }
}

step3:比对参考基因组

第二步中已经对标记位点进行分类整理,接下来将其填入参考基因组对应区间,看看有哪些基因或QTL,主要流程如下:

Ref_file <- "data/Ref.csv"
Ref <- read_csv(Ref_file)
id_list <- list.files("./out/3_Gene_Maping_Result/")
index <- 8
for (id in id_list){
  now <- read.csv(paste0("./out/3_Gene_Maping_Result/",id))
  atom <- str_split(id,"[.]")
  job <- atom[[1]][1]
  tem <- bind_cols(tem,now[,8])
  colnames(tem)[index] <- job
  index <- index + 1
  print(id)
}
for (i in 1:nrow(tem)){
  # 判断每个基因有多少个对应的位点
  tem$End[i] <- ncol(tem) - sum(tem[i,8:ncol(tem)] == "") - 7
}
colnames(tem)[4] <- "CountSNP"

如果想将多个表型或者环境的结果合并到一起,可以通过下面的代码进行操作:

tem$all <- NA
# 将多个环境区的数据合并到同一列-----------
for (i in 1:nrow(tem)){
  var_add <- c()
  for (m in 8:(ncol(tem)-1)){
    if (tem[i,m] == ""){
      next
    }else{
      var_add <- c(var_add,tem[i,m])
    }
  }
  add_info <- str_c(var_add,sep = "",collapse = " ; ")
  tem$all[i] <- add_info
}
all_col <- tem[,ncol(tem)]
out <- cbind(tem[,1:7],all_col,tem[,8:(ncol(tem)-1)])

由于上述过程涉及到两次迭代循环,计算量比较大,因此对其进行重构优化,实现并行计算,方法如下:

# 多线程重构并行运算-----------
library(foreach)
library(doParallel)
library(stringr)
# 获取计算机可用线程数
num_cores <- parallel::detectCores() - 2
cl <- makeCluster(num_cores)
registerDoParallel(cl)
n <- nrow(tem)
result <- foreach(i = 1:n, .combine = rbind) %dopar% {
  var_add <- c()
  for (m in 8:(ncol(tem)-1)){
    if (tem[i,m] == ""){
      next
    } else {
      var_add <- c(var_add, tem[i,m])
    }
  }
  add_info <- stringr::str_c(var_add, sep = "", collapse = " ; ")
  tem$all[i] <- add_info
  return(tem[i, ])
}
# 关闭并行计算
stopCluster(cl)
registerDoSEQ()
# 将结果写回原始数据框tem
tem <- result

step4:特殊结构变异区段查找

有一些大范围的结果变异,比如CNV等也比较重要,因此通过以下算法实现CNV类型初步判断与整理:

opt_snp_near <- 300*1000 # 相邻片段的最大间距,默认为300kb
opt_windows <- 2*1000*1000 # CNV片段的最小宽度,默认阈值为2MB,若连续位点跨度大于该值表示CNV
# CNV的评判标准:在连续型位点中,第一个位点和最后一个位点的间距跨度大于opt_windows

CNV_find <- as.data.frame(matrix(ncol = 7,nrow = 0))
colnames(CNV_find) <- c("p1","p2","info","chr","number","gap","type")
for (page in 1:length(SNP_near_all)){
  job <- names(SNP_near_all)[page]
  print(job)
  job_name <- str_replace(job,".csv","")
  if (nrow(SNP_near_all[[page]]) < 3){next} # 过滤小于2行的数据集
  df <- SNP_near_all[[page]]
  df$gap <- as.numeric(df$p2) -as.numeric(df$p1)
  df$type <- NA
  for (i in 1:nrow(df)){
    # 判断三种特殊情况,过滤具有单个位点的染色体
    if (i == 1 & df$chr[i] != df$chr[i+1]){df$type[i] <- "del";next}
    if (i == 1 & df$chr[i] == df$chr[i+1]){
      if (as.numeric(df$p1[i+1]) - as.numeric(df$p2[i]) < opt_snp_near){
        df$type[i] <- str_c(job_name,"_CNV_1")
        next
      }else{next}
    }
    if (i == nrow(df) & df$chr[i] != df$chr[i-1]){df$type[i] <- "del";next}
    if (df$chr[i] != df$chr[i-1] & df$chr[i] != df$chr[i+1]){df$type[i] <- "del";next}
    
  }
  df <- df[which(is.na(df$type)),] # 删除单个染色体
  if (nrow(df) == 0){next} # 若删除后数据为空则跳过
  # 进行CNV判断
  temp_type <- 1 # CNV片段分类计数
  for (i in 1:nrow(df)){
    foot <- 0 # 记录前进步数
    if (!is.na(df$type[i])){
      next
    }
    is_add <- F # 记录是否添加CNV
    # 最后一行特殊处理
    if (i == nrow(df)){ 
      if (as.numeric(df$p1[i]) - as.numeric(df$p2[i-1]) < opt_snp_near){
        df$type[i] <- df$type[i-1]
      }else{next}
    }
    
    for (index in (i+1):nrow(df)) { #从下一行开始查找连续区段,直到终止
      # if (foot != 0){foot <- foot -1 ;next}
      if (as.numeric(df$p1[index]) - as.numeric(df$p2[i+foot]) < opt_snp_near){
        df$type[i+foot] <- str_c(job_name,"_CNV_",temp_type)
        df$type[index] <- str_c(job_name,"_CNV_",temp_type)
        is_add <- T
        foot <- foot + 1
      }else{
        break
      }
    }
    if (is_add){
      temp_type <- temp_type +1
    }
  }
  out <- df[which(!is.na(df$type)),]
  CNV_find <- rbind(CNV_find,out)
}

行文至此,流程结束!

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