MALBAC-单细胞DNA测序原理

本文是陈魏学基因视频-单细胞DNA测序原理 笔记

方法特点

1. Phi 29 聚合酶保证了扩增效率和全基因组的覆盖；
2. 链内杂交，自我锁定，保证了线性扩增；

MALBAC-原理

细节

1. MALBAC- primer
2. MALBAC- Phi 29 聚合酶
3. MALBAC 循环
4. MALBAC 循环的产物

MALBAC- primer

• 通用序列：是PCR扩增时，引物结合序列
• 随即序列：随机杂交到基因组DNA的互补序列上，基因组DNA每个位置结合到这个随机序列的概率一样，所有位点有相同的机会被扩增

MALBAC- Phi 29 聚合酶

• Phi 29 聚合酶不仅可以在模版上合成新链，还可以把以合成好的新链解链用于合成新链，一次在模版上聚合出多个新链（再解链再合成，实现一个循环就可以扩增几十倍，几百倍），实现扩增效率的保证；
• Phi 29 聚合酶保证每个模版在5个MALBAC 循环后，得到5*n^2个扩增片段，保证大多数基因组区域被建成文库，实现全基因组的覆盖；

5 个 MALBAC 循环

第一个MALBAC 循环

第二个MALBAC 循环

每个循环的最后58度退火

• 链内杂交，自我锁定，无法扩增：使3'端序列不能与新的游离的引物杂交，从而不会发生起始于3'端的扩增，避免完整扩增的产物的自我指数级扩增

扩增得到3种产物

完整扩增产物

• m : 扩增次数
• n : 每个循环中，结合到模版上的扩增引物的数量
• 线性扩增：完整扩增产物数量N = m * n^2，所有N与m是线性关系，保证了均匀扩增，避免了指数级扩增带来的测序深度不平衡的问题

半扩增产物

原始的DNA模版