CRISPR-Cas9基因编辑7--测序验证敲除

前言：

使用挑单克隆技术得到多个单克隆细胞系后，就要开始验证敲除，除了蛋白表达水平的检测，最终还是要看测序结果。关于测序的方案也是各有不同，由于之前选用的是CRISPR-Cas9 NHEJ介导的编辑方法，因此测以sgRNA为中心点，长度约为500 bp的目的序列即可查看基因编辑后的基因型。而对于依赖模板的HDR介导的CRISPR-Cas9编辑方法，则检测方法要更加复杂一些。在这里，需要提一句的是，基因编辑不仅仅是切就完事了，Cas9造成DNA双链断裂（DNA double breaks, DSBs） 之后，有多种DNA修复方式，而细胞修复能力的强弱，也决定着基因编辑的效率。这或许是为什么不同的细胞的编辑效率有差的另一个原因。

实验正文

1. 实验准备

常规试剂：基因组DNA提取试剂盒，Taq DNA Polymerase （以下简称Taq，如果有条件可以配备Platinum™ Taq DNA Polymerase High Fidelity ），Q5® High-Fidelity DNA Polymerase（以下简称Q5） ，胶回收试剂盒，TA Cloning™ Kit, with pCR™2.1 Vector（以下简称T4载体） ，感受态细胞.

2. 实验步骤

将单克隆细胞种到6孔板中，约80%融合度后提取基因组DNA。以基因组DNA为模板，用Taq PCR实验P出目的基因条带。

因为Taq DNA聚合酶P出来的条带带有A尾，可连接T4载体，因此，任何可以使得P出来的产物带A尾的DNA聚合酶都可以使用。倘若课题组有平端的测序用载体，则可以使用Q5高保真DNA聚合酶。这里PCR产物需要考虑能否和后续测序载体匹配。总结如下：

1. Taq DNA聚合酶--PCR产物带A尾，可连接TOPO T4载体；
2. NEB Q5高保真DNA聚合酶--PCR产物为平端，需要连接平端的测序载体；
3. 当没有平端测序载体时，又想用Q5高保真DNA聚合酶PCR，需要将PCR产物加A尾之后，再连接TOPO T4载体；
4. 有条件可以购买Taq 高保真DNA聚合酶；
5. 普通Taq DNA聚合酶也是可以的，但PCR产量不如Q5。

image.png

（1）基因组DNA提取后PCR

由于课题组条件限制，我们只有T4测序载体，这个载体要求PCR产物是有A尾的。但是我们课题组并没有高保真的Taq DNA聚合酶，因此我使用Q5高保真DNA聚合酶完成PCR扩增实验，选择50 µl体系，不加GC Enhancer。

COMPONENT	25 µl REACTION	50 µl REACTION	FINAL CONCENTRATION
5X Q5 Reaction Buffer	5 µl	10 µl	1X
10 mM dNTPs	0.5 µl	1 µl	200 µM
10 µM Forward Primer	1.25 µl	2.5 µl	0.5 µM
10 µM Reverse Primer	1.25 µl	2.5 µl	0.5 µM
Template DNA	variable	variable	< 1,000 ng
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase	0.25 µl	0.5 µl	0.02 U/µl
5X Q5 High GC Enhancer (optional) 当模板为GC-rich序列时使用	(5 µl)	(10 µl)	(1X)
Nuclease-Free Water	to 25 µl	to 50 µl

（2）纯化PCR产物

将PCR扩增产物，跑上琼脂糖凝胶电泳，而后使用胶回收试剂盒回收PCR产物。这步骤按照试剂盒说明书即可，注意凝胶电泳的条带要亮亮亮亮亮亮的，回收回来的量才够用。这部分按照产品说明书操作即可。

将PCR产物，配合目的基因单边引物，送样测序。

（2.1）加A尾，从而使得PCR产物可以与T载体相连接

Set up the reaction system

Component	3 μL system
Q5 PCR products	1 μL
10 x PCR buffer (NH4)2SO4	0.3 μL
10 mM dNTPs	0.5 μL
Taq DNA Polymerase	0.2 μL
Nuclease-free H2O	**1.0 μL **

72 ℃ incubation 20-40 mins (we use 40 min at this time)

（3）PCR产物连接T载体后转化感受态细胞

以Theromo公司T4载体为例

Set up reactions

Component	3 μL system （来自上个步骤）
Q5 PCR products with A tail	0.5 μL
Salt solution	0.5 μL
Nuclease-free H2O	1.5 μL
PCR4-TOPO vector	0.5 μL

incubation at RT for 5 minutes

（4）划平板挑克隆扩增

（5）送样测序

先送PCR产物测序，根据PCR产物测序结果再考虑是否送T载体测序。如PCR产物测序结果显示为有基因变化、套峰等，则可送单克隆菌落测序。

（6）使用Snapgene软件查看测序结果

打开目的基因序列文件，按下图操作。

image.png

载入需要比对的序列文件，查看序列是否为野生型，是否为双峰。

image.png

对于以NHEJ介导的基因编辑方法，其主要靠碱基缺失或插入不为3的碱基数，造成后续阅读框移码突变，从而可能造成蛋白系列或空间构象改变，蛋白失去原有的功能，因此达到敲除的目的。

（1）序列如为野生型则说明基因编辑失败；

（2）测序序列如为双峰（套峰）则说明是杂合子，可手动拆开查看基因序列，同时还需将单克隆菌液送测序以得到完成的测序结果；

（3）如为纯合子则说明等位敲除了同样的碱基。碱基变化数目为3的倍数时，因无法造成移码突变，敲除可能会失败。需要碱基变化数目不为3的倍数，才可算成功，如上图所示，有一条链缺失了一个C碱基，因此造成后面阅读框的移码突变，蛋白失效则达到敲除的目的。