喜欢就关注微信公众号（荧光探针文献分享）吧，订阅更多最新消息
研究的背景
蛋白质化学修饰是蛋白质工程和偶联构建生物药物的有力手段。选择性标记蛋白质的能力，特别是在活细胞中，对于表征蛋白质的功能、定位和动力学研究至关重要。精确的蛋白质标记可以通过基因工程方法实现，例如与荧光蛋白融合，自标记标签(例如SNAP-Tag，CLIP-Tag，和HaloTag)。然而，体积较大的融合蛋白(19−33 kDa)可能会干扰POI的功能。
最重要的是，这些方法只能应用于能够进行基因操作的细胞水平。用小分子直接化学修饰内源蛋白质是一种蛋白质修饰的新方法，这种方法的优势在于小分子本身的体积小，并且不需要基因编辑，可以最大限度地减少对蛋白质的功能的干扰。
然而，基于小分子的活细胞蛋白标记的例子非常少。具有代表性的是滨池小组等开发的配体导向化学。他们的策略依赖于蛋白质上的亲核残基与探针的亲电部分反应，然而，这可能会由于氨基酸覆盖范围的限制和竞争水解反应而影响标记效率。因此，开发新的化学方法对天然内源蛋白进行选择性修饰已成为最重要的挑战之一。
卡宾介导的插入反应已被证明是蛋白质标记中的一种通用方法，因为它们能够修饰大范围的残基。最广为人知的卡宾前体之一是重氮化合物，它们最近在化学生物学中得到了广泛的应用。反应性卡宾中间体也可以由重氮和重氮化合物光化学生成，以标记细胞中的蛋白进行光亲和性蛋白分析。
然而，它们的激活需要紫外线照射，并且激活的过程中活性氧的产生对生物分子和细胞有害，这阻碍了在细胞中的应用。如何以生物正交的方式设计新的重氮化合物来修饰活细胞中的特定蛋白质仍然是一个具有挑战性的问题。
本文的工作
方案 1
在这里，作者提出了一种新的光化学方法，通过将重氮基团连接到扩展的π共轭体系，也就是荧光团，使重氮基团的激发波长从254 nm大幅红移到可见光区域，并且能够以生物相容性的方式标记特定的细胞内蛋白质，不再需要点击化学的两步反应(方案1a)。
这样的蛋白质修饰策略有几个优点。首先，与使用二叠氮、二苯甲酮、芳基叠氮、四唑、和α-酮酰胺的方法相比，使用长波(400−800 nm)照射可以避免紫外光的细胞毒性。其次，铜(I)催化的叠氮化物−炔环加成反应(CuAAc)或其他通常需要引入荧光团的反应可以省去，这使得标记蛋白质的实时报告成为可能。此外，光化学方法为精确的蛋白标记提供了快速和非侵入性的方法。
(1)重氮香豆素的吸收和发射光谱
图 1
化合物2(标签)的最大吸收波长：400nm，最大发射波长：484nm，图 de表明标签经过光照后的产物大部分都有荧光。
(2)对重组CA-II进行重氮香豆素标记
图 2
碳酸酐酶Ⅱ(CA-II，29 kDa)作为选择性标记的靶标，被广泛的应用于亲和探针的研究中。Ca-II可被芳香族伯磺酰胺如4-羧基苯磺酰胺(CBS)可逆抑制(KD∼3.2 μM)。因此，作者通过修饰7-氨基上的一个乙基取代基来连接CBS，从而设计并合成了3(图 2a)。
CA-II在体外与3混合，然后蓝色LED照射(图 2b)。如所得的SDS-PAGE所示，3对CA-II的标记以浓度(图 2c，EC(50)：2.48 μM)和时间(图 2d)依赖的方式提供，并通过与过量CBS的竞争而减弱(图 2e，IC(50)：182 μM)。
酶活性测定表明，3的IC50值与CBS相当(图 2f，3的IC50值为0.90 μM；CBS的IC50值为2.14 μM)。这些结果表明，尽管磺酰胺与CA-II相互作用不大，但其结合性能并未被破坏。此外，LC/MS/MS分析显示3标记的CA-II的N-端肽的His2和Trp4残基(图 2g)。这两个残基都位于配体结合口袋的入口处(图 2h)，表明标记是由CA-II和3之间的特异性相互作用诱导的。
(3)活细胞内源性CA-II的标记
图 3
作者使用活体MCF7人乳腺癌细胞和HCT116人结直肠癌细胞进行标记，这两种细胞都是内源性表达CA-II的细胞。与3孵育后，用蓝色LED灯照射细胞(图 3a)。随后，收集细胞裂解产物，用SDS-PAGE分离荧光信号。在MCF7细胞的SDS-PAGE中观察到一条与CA-II相对应的强单一荧光带，但可被CBS共处理所阻断(图 3b，3和4组)。在没有照射的情况下观察到了一个较弱的带(图 3b，2组)，这表明在黑暗中发生了一个轻微的反应。当siRNA下调MCF7细胞CA-II的表达时，凝胶内荧光信号消失(图 3c)。综上所述，这些结果明了可见光诱导的CA-II在活细胞中被重氮香豆素特异而快速地标记。
由于重氮香豆素探针3独特的荧光性质和标记条件的生物相容性，可以进行细胞内CA-II的活细胞成像，这是其他方法难以实现的。经蓝光LED照射后，HCT116细胞有较强的荧光(图 3d)。此外，3的荧光信号在细胞中被保留的事实也证明了共价键是对光的响应而建立的。
(4)模拟缺氧条件下CA-IX的标记
图 4
CA-IX是CAs的一种膜相关亚型，在缺氧肿瘤细胞中高表达。由于CA-IX在恶性进展中起关键作用，特别是在酸性细胞外基质下调节pH稳态方面，CA-IX被认为是一种有价值的生物标志物，也是肿瘤治疗的一个有吸引力的靶点。
CA-IX的表达受缺氧诱导因子1(hif-1)的调节，在常氧条件下，该因子在脯氨酸残基上被脯氨酸羟化酶结构域蛋白2(Phd2)羟基化，随后被von hippel−linau(Vhl)e3连接酶泛素化以降解蛋白酶体(图 4a)。在该实验中，不表达CA-II的HeLa细胞在正常或模拟缺氧条件下培养(用DFO处理)。
从图 4b所示的Western blot结果可以看出，由于HIF-1的积聚，CA-IX表达上调。然后，用3处理这些细胞，然后用蓝光LED照射。由此得到的活细胞共聚焦图像显示，DFO处理的细胞质膜上积累了大量信号，而未处理的细胞显示出极小的信号(图 4c)。大多数信号可以通过CBS的共处理而荧光强度减弱。这表明在模拟缺氧条件下，3可以荧光标记膜结合的CA-IX。结果表明，该探针可以用来标记在特定条件下动态表达的蛋白质，这是基因修饰的过表达系统很难做到的。
(5)原位双光子标记和成像
图 5
双光子激活(更长的激发波长)会降低光毒性，提高组织穿透力。因此，作者测试了利用近红外(NIR)光引发反应，双光子激活2生成卡宾的可行性。当2暴露在800 nm聚焦激光束的飞秒脉冲下时，观察到与蓝光照射相似的光化学反应(图 5a)。记录了荧光增加对聚焦激光功率的依赖性； 但是，当激光未聚焦时，没有反应发生(图 5b)。
这些结果表明，2可以被近红外光激活为双光子。在活细胞中进行了CA-II的原位双光子标记和成像(图 5c)。在本实验中，用3处理MCF7细胞，并首先在共聚焦显微镜下用NucRed追踪细胞的位置。接下来，只用显微镜800 nm处的激光照射选定的细胞。然后清洗多余的探针，对细胞进行成像。如图 5c所示，在暴露于近红外光的细胞中检测到更强的荧光信号，这表明在活细胞中可以实现CA-II的双光子激活标记。
(6)EDHFR在活细胞中的标记
图 6
为了证明该标记策略也可以应用于其他靶蛋白，作者通过加入甲氧苄啶(TMP，KD∼10 nM)作为配体合成了4，它可以选择性地结合大肠杆菌二氢叶酸还原酶(EDHFR)。转染质粒DNA使eDHFR与红色荧光蛋白(mCherry-eDHFR)融合表达。该融合蛋白的转染有助于在共聚焦显微镜下证实与重氮香豆素在活细胞中的共定位。当细胞用4(5 μM)处理并用蓝光照射时，活细胞成像中观察到探针信号和mCherry共存(图 6b)。尽管未转染的细胞未显示任何染色，但TMP的添加可以干扰转染细胞中的标记。
文献原文：Dai, S. Y.; Yang, D., A Visible and Near-Infrared Light Activatable Diazocoumarin Probe for Fluorogenic Protein Labeling in Living Cells. J Am Chem Soc 2020, 142 (40), 17156-17166.
Doi：10.1021/jacs.0c08068
感谢您的支持。根据大家对前边我总结的荧光探针可以投的杂志的补充，我重新整理了一份Excel。因为直接发在推文中格式非常难看，所以如果您需要只需要在后台回复“杂志”就可以获得百度网盘的下载地址(没有任何广告，单纯因为格式太丑了)。如果您有什么补充，欢迎您在后台留言。
祝您开心，顺利。