真核有参转录组测序标准分析

本篇文章主要站在你是分析数据者的角度来讲解，一些测序建库的原理与操作我只做简要说明，甚至一笔带过。关于更多详细内容大家都可以百度了解。主要的篇幅是从公司拿到双端测序的fq.gz后的故事。

准备：一台服务器，参考基因组，基因注释文件。

RNA-seq简介

转录组测序数据产生(简述)

将表型特异的组织提取RNA，然后送到测序公司，经过质检合格后，公司为RNA加接头，PCR富集，开始在仪器中测序。数据下机，发到客户手里。

转录组测序数据量与下机数据(简述)

不同物种的基因数量与大小都不尽相同，因此具体情况具体分析，可以跟导师商量讨论后在做决定。以我所在的实验室为例，二倍森林草莓基因组220M，共计大约34000个基因，一个样品测序数据量选择6G(这里的数据量指的是原始数据中碱基的数量，不是文件大小)。另外，测序策略一般都是选择双端测序，建库类型选择真核普通转录组文库。若注释基因组，则选择真核链特异性文库(此文库以后的文章会讲)。

公司的下机数据都是rawdata形式的，这是最原始数据，其中包含一些质量不好的碱基，并且还有接头序列。一般会让公司做去除接头并且去除质量不好的reads，拿到cleandata数据，做这个操作好像一个样加10块(这几天送样做三代测序和二代基因组重测序，公司告诉我这个操作不要钱，都是直接给客户cleandata)。总之，我实验室的其他人都是直接告诉公司要cleandata。Rawdata自己也要保存一份。并且公司还有给一个md5.txt之类的文本(文件很重要，检查文件的完整性)。

测序数据上传到服务器

我个人一直用Xftp7(https://www.xshellcn.com/xiazai.html)上传数据到服务器中，填写信息后就会把软件发到邮箱中，下载安装即可。安装后，点击右上角文件，新建。

名称：自己随便设置

主机：填写服务器IP。

方法：选择Password。

用户名与密码：填写你在服务器下的账户名与密码即可。

连接成功后，如下图。

两边都可以互相传输，用鼠标选择文件与要传输到的文件夹，右击传输即可。

检查文件的完整性

首先第一步先检查文件是不是完整的。因为可能在下载文件的过程中断网，电脑死机黑屏导致文件没有下载完全，但是没有消息提示你，因此必须检验文件是否完整。

举例：

这是公司给我的一个样品双端测序的文件，并且还有一个md5.txt文本。

hsq_md3.txt内容如下：

第二列是检验的文件名，第一列是文件对应的”数字密码”，检测时，如果能对应上第一列的数字，则文件完整。检测时，文件与md5.txt文本必须在同一目录下。

命令：md5sum-c hsq_md5.txt

结果如下：两个OK，表示文件完整。

我将s1_1.clean.fq.gz提取前1000行，文件名设置一样。结果如下：

可以看到s1_1.clean.fq.gz显示FAILED，说明文件不完整。

本节先介绍到这里，下节会介绍如何查看测序文件以及fastqc检测测序文件。

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