重测序专题（一）| 一文了解测序技术的发展

全基因组重测序（Whole-genome re-sequencing），就是对已有参考基因组的物种个体进行再次测序。它可以对单独个体，也可以对群体进行研究。运用全基因组重测序手段，在医学上我们可以提供个性化、精准化医疗，在农业上我们可以大大提高分子育种的效率。因此，目前全基因组重测序不管是科研还是临床，均为重要的研究手段。

测序，是解密基因组最重要的手段。随着技术的进步，测序技术也经历了多代的发展。限于篇幅原因，本期小编先介绍测序技术的发展历史，以及全基因组重测序目前所用到的测序手段。

一代测序

1977年，英国生物化学家弗雷德里克·桑格（Frederick Sanger）发明了双脱氧链终止法，该方法也是人类基因组计划所使用的主要方法，他也因为该方法第二次获得了诺贝尔奖。Sanger法也被称为一代测序技术，其基本原理是在DNA复制过程中引入双脱氧三磷酸核苷酸（ddNTP），由于缺少3'-OH基团无法与脱氧三磷酸核苷酸（dNTP）形成磷酸二脂键，导致反应终止。

早期的Sanger测序是通过跑胶来判断碱基的顺序，而随着Sanger技术的发展，不同的ddNTP可以被不同的荧光基团所标记，通过不同的颜色来判断不同的碱基。同时Sanger测序高达99.999%的正确率也让人印象深刻。

 Sanger测序

二代测序

尽管目前已经出现了十分成熟的自动化Sanger测序仪，但其测序长度（~1000bp）和通量依然十分有限，单碱基测序成本高昂。于是在2005年，Roche公司发布了第一台二代测序仪：454 GS20。二代测序又被称为次世代测序（Next Generation Sequencing, NGS），相较于一代测序一次只能测一条序列，NGS可以一次同时测几十万到上百万条序列，大大加快了测序速率。尽管NGS单条测序的序列较短，并有一定的错误率，但随着技术的发展，序列的拼接算法已经有了极大的优化，正确率也提高到99%以上。

目前主流NGS测序方法包括Roche公司的454测序，Illumina公司的Solexa技术，ABI公司的SOLiD技术以及华大公司的BGISEQ/MGISEQ等。这些测序技术有一些共同的特征，首先需要将总的DNA或RNA片段化，并将统一的接头序列连接到每一个片段末端。这些接头包含独特的信息，可以在同一个反应中区分不同的样本，同时接头中又包含通用引物，因此单个PCR反应可以扩增所有序列。然后接头会与连接在磁珠或板子上的互补序列配对，利用接头末端的通用引物进行PCR扩增。而测序的过程就在该阶段发生，通常二代测序的结果序列较短从几十bp到几百bp之间不等。由于其低廉的成本和拼接算法的逐步完善，二代测序成为目前重测序的主流技术手段。

 454 (a)和Solexa (b)PCR扩增原理

 华大公司测序原理

三代测序

虽然NGS依然是现阶段主流测序手段，但它读长短的缺点却越来越无法被忽视。为了解决这个难题，以PacBio公司的SMRT技术和ONT公司的纳米孔测序技术为代表的第三代测序技术应运而生。与前两代测序技术相比，其最大的特点就是无需PCR扩增的单分子测序，并且理论上可以测定无限长度的核酸序列。

SMRT技术的特点是利用ZMW孔将DNA聚合酶，待测序列和不同荧光标记的dNTP置于孔的底部。由于孔内一次只能进入一条序列，当有DNA模板与底部的聚合酶结合后，4种带有不同荧光标记的dNTP通过聚合酶与模板链进行碱基互补配对，由于生成化学键的时间要远远长于其他碱基停留的时间，因此可以通过荧光信号判断不同的碱基。

而纳米孔技术的特点与SMRT类似的是同样需要小孔，但不同的是我们测量的序列需要穿过小孔。该小孔是由放置在电阻性聚合膜的蛋白质组成的，具有纳米级别，因此又称为纳米孔。在测序建库时，连接在测序片段的测序接头上需要连接特殊的马达蛋白，当测序片段通过纳米孔时，由马达蛋白驱动测序序列的一条链通过小孔，在测序序列穿过电阻膜的过程中，会引起其上的电流变化，通过实时检测并解码这些电流信号便可以确定碱基序列。

与二代测序最多上百bp的测序长度相比，三代测序的测序长度可以高达上百kb，并且没有GC的偏好性，以及PCR扩增的干扰，同时还可以检测到核酸上的甲基化等修饰。但成本和错误率偏高，也是目前三代测序的痛点，不过随着技术的发展，三代测序也将会逐渐取代二代测序成为测序的主流。对于目前的重测序来说，三代测序更多的是用在参考基因组的组装，填补已有参考基因组的gap上，如目前最火热的T2T基因组，正是由于有了超长测序读长的三代测序加入，才能将二代测序无能为力的长简单重复序列问题彻底解决。

 SMRT测序原理

 纳米孔测序原理

测序技术经过近50年的发展，使我们对基因组的认识从几十bp碱基到完整染色体，足见其对我们认识自然的助力之大。但仅仅将基因组的序列测出来还远远不够，对这些序列的解读才是更加重要的。在后面第二期和第三期文章中我们将从个体和群体层面解读全基因组重测序可以解决哪些实际问题，尽请期待~

◆  全基因组重测序产品介绍  ◆ 

全基因组重测序是对已知基因组序列的物种进行不同个体的基因组测序，并在此基础上对个体或群体进行差异性分析。全基因组重测序的个体，通过序列比对，可以找到大量的单核苷酸多态性位点（SNP），插入缺失位点（InDel，Insertion/Deletion）和结构变异位点（SV，Structure Variation）等信息，从而应用于检测致病基因、遗传变异、产前筛查、个性化医疗等众多领域。

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