组蛋白ChIP-seq研究思路及应用案例分享

往期推文中我们分享了不少ChIP-seq的项目文章，今天和大家聊聊ChIP-seq的研究思路和应用案例。

ChIP-seq技术将染色质免疫共沉淀与二代测序结合，高效地在全基因组范围内检测与组蛋白、转录因子等互作的DNA序列。从概念的角度看，ChIP-seq的研究对象主要是与组蛋白、转录因子等互作的DNA序列，小编将从组蛋白、转录因子两个方向谈谈ChIP-seq的研究思路和应用，本期先聊聊组蛋白ChIP-seq。

01 组蛋白背景知识

染色体的基本单位是核小体，而核小体是由DNA序列与组蛋白组成的。147bp的DNA序列缠绕在组蛋白八聚体上，组蛋白八聚体有4种组蛋白：H2A、H2B、H3和H4。

 图来自https://en.wikipedia.org/wiki/Histone

组蛋白蛋白结构在N端有一段“尾巴”，组蛋白修饰通常发生在这些尾巴上面。组蛋白修饰是以共价方式进行的蛋白质翻译后修饰，常见的组蛋白修饰包括甲基化、磷酸化、乙酰化和泛素化等。

组蛋白的命名是组蛋白结构+氨基酸名称+氨基酸位置+修饰类型。比如：H3K4me3代表H3组蛋白的第4位赖氨酸的三甲基化。

常见组蛋白修饰位点

The Histone Modification Code in the Pathogenesis of Autoimmune Diseases

组蛋白修饰一般会影响转录活性，其通过影响组蛋白与DNA双链的亲和性，从而改变核小体结构以及染色质的疏松或凝集状态，或通过影响其他转录因子与结构基因启动子的亲和性来发挥基因表达调控作用。由于组蛋白修饰会改变染色质的疏松或凝集状态，染色质的可及性也会发生变化。

02 组蛋白甲基化和乙酰化

◆ 组蛋白甲基化 ◆ 

组蛋白修饰类型中研究较多的是甲基化和乙酰化。组蛋白的甲基化修饰是受到组蛋白甲基化转移酶（HMTs）和组蛋白去甲基化酶（HDMs）调控的。组蛋白甲基化通常发生在H3和H4的精氨酸和赖氨酸残基上。它们都可以被单甲基化或二甲基化，其中赖氨酸还可以被三甲基化。

组蛋白精氨酸甲基化可以促进转录，而赖氨酸甲基化修饰在不同位置，行使的功能不同，有的位置促进基因的表达，有的则会抑制基因的表达。不同程度的甲基化也会带来不同的功能，比如组蛋白H3K4的单甲基化和三甲基化，H3K4me1通常会标记转录增强子，H3K4me3则会标记基因启动子。

◆ 组蛋白乙酰化 ◆ 

组蛋白乙酰化受到组蛋白乙酰转移酶（HATs）和组蛋白去乙酰酶（HDACs）调控。该修饰通常发生在赖氨酸上，促进基因转录的表达。其原理是乙酰化修饰可以中和组蛋白的正电荷，而DNA是带负电荷的。乙酰化修饰越多，组蛋白与DNA的结合就会越松散，这样转录因子和RNA聚合酶也越容易接近DNA，对基因表达的促进也就越强。比如H3K27ac/H3K9ac之类的，K27ac通常结合在增强子上的，K9ac通常结合在启动子上的。

03 新型组蛋白修饰

除了上面提到的常见组蛋白修饰，近些年发现了很多新型修饰类型。比如：丙酰化、丁酰化、2-羟基异丁酰化、琥珀酰化、丙二酰化、戊二酰化、巴豆酰化和β-羟基丁酰化。2019年Nature发表了一篇名为“Metabolic regulation of gene expression by histone lactylation”的报道，该研究发现了组蛋白乳酸化对基因表达的代谢调节[1]。

除了常见的修饰类型，爱基百客在非常规的组蛋白修饰上也有项目经验，有需求的老师可以和我们联系沟通。爱基往期推送过一篇组蛋白巴豆酰化的客户文章《客户文章 | IF=7.561 猪肺泡巨噬细胞组蛋白巴豆酰化组学助力弓形虫感染诱导的免疫机制研究》。该研究就是利用爱基的ChIP-seq技术对弓形虫感染猪肺泡巨噬细胞的巴豆酰化进行了全面系统的分析。

 弓形虫导致猪肺泡巨噬细胞H2BK12cr降低。

04 组蛋白联合研究思路

组蛋白ChIP-seq研究有2种思路：组蛋白修饰功能未知，根据ChIP-seq识别的序列信息，来推测这种修饰的功能；组蛋白修饰功能已知，利用ChIP-seq识别这种组蛋白修饰标记的特定基因和区域，进一步研究这些基因或区域的功能。另外，组蛋白修饰并不是单独发挥作用影响基因的表达，所以大部分组蛋白ChIP-seq会联合多种组学技术，从多个方向分析阐明科研问题。

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◆ 组蛋白ChIP-seq与WGBS ◆ 

DNA甲基化中某一段序列的CpG位点的C碱基可以被甲基化，而其通常又会影响DNA序列与转录因子的结合，进而影响基因的表达活性。组蛋白修饰可以与DNA甲基化共同发挥作用的，因此，有些研究是将ChIP-seq与WGBS技术联用，例如下面这篇New Phytol杂志发表题为“SlJMJ7 orchestrates tomato fruit ripening via crosstalk between H3K4me3 and DML2-mediated DNA demethylation”的研究论文，联合ChIP-seq、WGBS以及RNA-seq，发现了SlJMJ7调控番茄成熟的表观机制。

SlJMJ7调控番茄果实成熟的机理

SlJMJ7 orchestrates tomato fruit ripening via crosstalk between H3K4me3 and DML2-mediated DNA demethylation

SlJMJ7在果实中积累，并通过H3K3me3去甲基化直接抑制乙烯合成基因、关键转录因子和下游成熟相关基因的表达。此外，SlJMJ7抑制DNA去甲基化酶DML2的表达，通过DNA甲基化间接抑制成熟相关基因的转录。

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◆  组蛋白ChIP-seq与RNA-seq  ◆ 

组蛋白修饰会影响转录表达，ChIP-seq与RNA-seq联合分析对于解读组蛋白修饰影响基因表达进而影响其功能的研究适配性高。比如，ChIP-seq在增强子方向的研究。

基因表达部分由增强子控制，增强子是一类順式调控元件，它可以在很长的基因组距离上在特定的细胞类型或发育阶段激活基因转录。靶向增强子相关染色质标记（比如H3K27ac）的ChIP-seq可用于构建感兴趣组织活性增强子的精确全基因组图谱。将其与转录组数据关联，可以将特定细胞或发育阶段的激活增强子与表达增加的基因联系起来。

 研究思路

以9月20日发表在Cell Rep的论文“Genome-wide fetalization of enhancer architecture in heart disease”为例。心脏病与关键转录因子的重新表达有关，这些转录因子通常只在心脏的产前发育过程中活跃。然而，这种重新激活对心脏病的调控格局的影响尚不清楚。该研究使用RNA-seq与ChIP-seq靶向与活性转录增强子相关的组蛋白修饰，从多达26名健康对照、18名特发性扩张型心肌病（DCM）患者和5名胎儿心脏的左心室组生成全基因组增强子图谱。

为了进一步评估DCM中差异活性增强子和差异表达基因之间的调节关系，作者检查了RNA-seq与ChIP-seq数据之间的相关性。以SMOC2基因为例，在其启动子上游20kb处检测到DCM特异性H3K27ac信号的增强，与DCM中SMOC2表达增加相关。

 特发性扩张型心肌病中SMOC2表达增加（RNA-seq）和附近增强子H3K27ac水平增加同时发生

◆ 组蛋白ChIP-seq与ATAC-seq ◆ 

组蛋白修饰会改变核小体结构，染色质可及性也会随着改变；另外，组蛋白修饰位点往往与转录调控的顺式作用元件紧密相关，而染色质可及性是转录激活的特征。因此，不少研究选择了ChIP-seq与ATAC-seq联合分析。

ChIP-seq与ATAC-seq的联用相比ChIP-seq与RNA的联用对于增强子的研究适配性更高一些。目前研究增强子的主要就是基于H3K27ac/H3K4me1的ChIP-seq、ATAC-seq、RNA-seq和HI-C。

 Dynamic transcriptome and chromatin architecturein granulosa cells during chicken folliculogenesis

 2022年1月Nature Communicaitons杂志发表题为“Dynamic transcriptome and chromatin architecture in granulosa cells during chicken folliculogenesis”的研究论文。研究中利用Hi-C、ATAC-seq、ChIP-seq和RNA-seq探讨了启动子与增强子之间的远程互作重连，其中H3K27ac是活性增强子的典型组蛋白标记物，通过分析H3K27ac的分布来比较增强子和启动子影响转录活性的差异。

05 应用方向及案例分享

上面谈了组蛋白ChIP-seq的多组学分析思路，下面再来看看它的应用方向。组蛋白修饰会影响核小体结构，意味着其可以影响DNA参与的过程——转录、复制和修复。因此，组蛋白修饰的应用范围广。

在医学方向，组蛋白调控癌症、炎症、免疫及神经等疾病的研究都是热点，组蛋白修饰也常常作为一些潜在的生物标志物和治疗靶点。在植物方向，组蛋白修饰参与植物的非生物胁迫、生长发育等生命过程。

◆  医学应用案例  ◆ 

文章标题：Small-molecule inhibition of the acyl-lysine reader ENL as a strategy against acute myeloid leukemia

发表时间：2022年9月2日

发表期刊：Cancer Discov（IF: 38.272）

技  术：ChIP-seq、RNA-seq、ChIP-qPCR等（爱基百客均可提供）

2022年9月，宾夕法尼亚大学万里玲实验室与费城儿童医院Kathrin M.Bernt实验室等在期刊Cancer Discov发表“Small-molecule inhibition of the acyl-lysine reader ENL as a strategy against acute myeloid leukemia”的研究论文。染色质阅读器ENL已被确定为急性髓细胞白血病的关键依赖性疾病，但其治疗潜力尚不清楚。在该研究中准备了一个ENL小分子抑制剂TDI-11055，其可以通过阻断ENL YEATS结构域与酰化组蛋白的互相作用。为了测试TDI-11055是否是细胞中ENL的染色质拮抗剂，研究者采用了ChIP-seq技术分析处理过的细胞。

结果表明TDI-11055治疗导致ENL从靶基因中大量转移，包括AML中已确定的致白血病基因，比如MYC和HOXA簇。由于TDI-11055治疗并没有降低细胞内ENL蛋白的整体水平，这些数据表明TDI-11055是一个有效且专门干扰活细胞中ENL染色质阅读器功能的工具。

组蛋白修饰调控的异常与包括肿瘤、神经退行性、免疫以及炎症在内的许多疾病的发生发展密切相关。正是由于组蛋白修饰在这些病理中的关键作用，组蛋白修饰成为发现潜在的生物标志物和治疗靶点的重要切入点。因此，医学方向的老师在做研究时可以考虑组蛋白ChIP-seq作为手段。

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◆  植物应用案例  ◆ 

组蛋白修饰在植物生长发育和环境响应过程中具有广泛而动态的调控作用。比如说组蛋白甲基化可以根据植物的需要在甲基化状态和去甲基化状态进行动态转换。2021年Current Opinion in Plant Biology期刊发表了一篇题为“Histone methylation in epigenetic regulation and temperature responses”的综述论文。文章总结组蛋白甲基化调控植物响应温度、开花时间的最新进展，并基于拟南芥的数据讨论了组蛋白甲基化在温度反应中的作用。

文章标题：Evidence of chromatin and transcriptional dynamics for cold development in peach flower bud

发表时间：2022年7月22日

发表期刊：New Phytol（IF: 38.272）

技  术：ChIP-seq、RNA-seq（爱基百客均可提供）

2022年7月帕多瓦大学在New Phytologist期刊发表题为“Evidence of chromatin and transcriptional dynamics for cold development in peach flower bud”的研究论文。该研究为了研究果树芽的花发育，以桃为研究对象，整合了细胞学观察数据、ChIP-seq等表观基因组数据和转录组数据，鉴定了低温积累过程中参与花发育的主要调控因子。研究结果显示低温环境桃花蕾并没有停止生长，但激素代谢和花芽发育关键基因的转录丰度、组蛋白修饰的分布（H3K4me3和H3K27me3）和DNA甲基化都出现了变化。在研究中，作者选用了3个不同低温条件的样本做ChIP-seq，监测H3K4me3和H3K27me3染色质标记物的动态变化。

 ChIP-seq分析、整合桃花芽的组蛋白标记富集和基因表达结果

组蛋白修饰在维持真核生物基因组稳定性、基因表达调控和染色质结构等方面发挥重要作用，组蛋白ChIP-seq的研究对于解析转录调控相关的表观机制具有重要价值。本期分享了组蛋白修饰的背景知识、组蛋白ChIP-seq多组学研究思路及其在医学、植物方向的应用案例。下期我们会继续分享转录因子ChIP-seq的相关思路，尽请期待吧~

有相关研究需求的老师，欢迎和我们沟通。

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[1] Sabari BR., Zhang D., et al. Metabolic regulation of gene expression through histone acylations. Nat Rev Mol Cell Biol. 2017. 18(2): 90-101.