系列笔记基于达澈生物讲座视频，从中初步学习了解生信分析中常遇到的组学分析技术。
ChIP-seq和 CUT&Tag、CUT&RUN讲座视频笔记 -
ATAC-seq讲座视频笔记 -
CLIP、RIP-seq讲座视频笔记 -
Ribo-seq讲座视频笔记 -
RIC-seq讲座视频学习 -
(eccDNA)circle-seq讲座视频学习 -

0、总纲

ChIP-seq是探究有特定蛋白结合的DNA片段，即蛋白与DNA特定区域的互作关系；
CUT&RUN、CUT&TAG是近些年提出的两个更高效的实验设计。

image from ENCODE

1、ChIP-seq（Chromatin Immuno-Precipitation）

染色体免疫共沉淀反应

1.1 上游实验原理

A 实验步骤

参考下图，主要分为5步

（1）甲醛交联

将目标蛋白（根据实验目的而定）紧密绑定到其可以与DNA连接的位置上；
目标蛋白是我们感兴趣的蛋白，例如有特定修饰的组蛋白；
我想就是为避免下一步超声时脱离；

（2）超声打断

将所有DNA打断成一定长度的小片段；
所有片段可分为两大类：有特定蛋白结合的，无特定蛋白结合的

5 steps of ChIP-seq

（3）片段富集

根据目标蛋白，添加特异抗体，形成抗体与目标蛋白免疫沉淀复合物；
然后用磁珠分离富集

（4）文库构建

去交联，纯化DNA；
加接头，扩增

（5）测序

illumina二代测序

B 技术难点

（1）实验步骤较多，参数设置优化

例如交联、超声等参数设置需要实验摸索；
整个实验周期大概三天左右。

（2）抗体选择

对于任何一种特定的靶抗原，都有不止一种有效抗体；
如何筛选高质量的抗体是很重要的（因为不做实验，就不细述了）

磁珠对蛋白免疫沉淀复合物的富集.png

（3）结果解读

chip-seq的结果有时存在背景高、非特异性的peak的缺点；即目标DNA片段分布不是很集中。原因可能如下

甲醛过度交联导致蛋白与非目标DNA位置结合；
非特异性DNA与Bead直接结合（solution：可用Salmon Sperm DNA封闭）；
抗体特异性不强；
........

C 对照设计

（1）input对照（必做）

即相同实验条件下，进行到第二步超声打断的结果。目的主要是

可以验证DNA断裂的效果（片段长度分布）

sonication超声
可根据input中靶序列的含量以及染色质沉淀中的靶序列含量，按照取样比例换算出CHIP的效率；

（2）阳性对照（选做）

主要目的是验证chip-seq实验理论上有目标蛋白结合就会出现peak的

一般使用anti-RNA PolymeraseⅡ抗体；
因为该抗体是通用转录因子，在所有细胞中都能结合基因的核心启动子区。因此理论上chip后都会有条带。

（3）阴性对照（选做）

主要目的是验证chip-seq实验理论上没有目标蛋白结合就会不出现peak的

一般用普通的IgG抗体

阳性、阴性对照的例图可见笔记最后

1.2 下游数据分析

参考下图，chip-seq的数据分析常规流程如下

（1）RAW data→Clean data

质控（QC）；
去接头(cutadapt)

（2）Alignment

bwa、bowties等biosoft，重点关注mapping rate
visualization(deepTools/IGV)

（3）Peakcalling

ChIP-seq的必做步骤，研究蛋白bindinng的DNA片段相对集中区域
MACS2软件，之前的关于MACS笔记见链接
根据peak分布结果可进一步尝试motif analysis(Homer)，gene annotation(Homer)→GO/KEGG(R)，并且联和RNA-seq DEG、ATAC-seq等

image from 达澈生物

2、CUT&RUN、CUT&TAG

ChIP-seq主要用超声打断的方式切割DNA片段，
近些年出现的CUT&RUN、CUT&TAG则主要利用酶切的方式

2.1 cut&run

cleavage under targets and release using nuclease
大致步骤如下

（1）抗体结合绑在DNA上的靶向蛋白；
（2）Protein A-MNase酶复合物与抗体交联；

MNase酶为DNA内切酶，可切断所识别到的DNA片段

cut&run

（3）钙离子激活MNase酶，剪下目标蛋白所连的目标DNA片段；
（4）蛋白复合物富集

2.2 cut&tag

cleavage under targets and tagmentation
大致步骤如下

(1) 一抗结合目标蛋白，二抗结合一抗(信号放大)；
(2) 加入protein A-Tn5酶复合物

Tn5酶是转座酶，ATAC实验常用，完成剪切、粘贴的作用；

cut&tag

剪下目标蛋白所连接的目标DNA片段，并在两边加上接头（建库更方便）

2.3 相比于ChIP-seq的优势

实验材料(细胞)使用量少，适合珍贵样品；
不需要超声打断，因此也可不做甲醛固定（前提是新鲜细胞）；
实验周期短，两天左右；
数据背景信号非常低！可参考一篇paper的比较

image from paper

ChIP-seq和 CUT&Tag、CUT&RUN讲座视频笔记