SDS-PAGE—快速制胶0失误

  “SDS-PAGE”是指“聚丙烯酰胺凝胶电泳”（polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE）。

    原理：聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。分为非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）和SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）；非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。SDS-PAGE最初由shapiro于1967年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂（SDS即十二烷基硫酸钠）后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小（可以忽略电荷因素）。

    聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。化学聚合（实验室常用）以过硫酸铵（APS）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。

    制好一块蛋白胶是WESTERN BLOT，PULL DOWN， Co-IP等实验的基础。虽然是个很简单的步骤，但也有许多值得注意的地方。实验小白的经验总结，大家可以参考参考。

  1.制胶用的胶板和梳子需要提前用ddH2O清洗干净。检漏时可以开始配置分离胶。

  2.检漏后需要用纸把水吸干净，避免有水残留。

  3.加入分离胶后用ddH2O封平，加水时用移液枪水平缓慢加入，一是为了使分离胶界面保持水平，用水就可以把它压平，使蛋白质分子跑时在同一水平线上；二是阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用。封好后一般静置15分钟左右。等待时间可以制备浓缩胶。

    4.待分离胶与水出现分层即表示分离胶凝固好了，吸干净水（否则易导致浓缩胶与分离胶中间有空隙）。用移液器缓慢加入浓缩胶（不要有气泡，可以不用把移液器里的液体打干净，这样不容易有气泡；有气泡了可以加入更多液体使气泡上浮再用移液器吸走气泡），及时插入梳子，静置15分子左右。

    5.一般加入TEMED(剧毒,使用时注意）的量按使用说明的量加入，夏季温度高时切勿多加。冬季温度低时可适量多加2到5微。

  个人心得，仅供参考。如有疑问，欢迎交流。