写在前面
这次分享的是前段时间发表在Nature的长文，"Quinone perception in plants via leucine-rich-repeat receptor-like kinases"。在植物中首先鉴定到一类LRR受体激酶作为醌类物质的受体，同时这一受体激酶之前被报道作为过氧化氢的受体。文章的筛选系统、切入的角度等都是值得我们好好学习的地方。
醌类物质的简单介绍
在动物和细菌中，醌类信号经常参与到感知蛋白半胱氨酸的修饰，植物是产生醌类物质的主要生物，在寄生植物的根中，醌类物质可以诱导吸器(一种特殊的营养结构)的产生，这一醌类主要是2,6-dimethoxy-1,4-benzoquinone(DMBQ)。
正文
前人证明，在寄生植物中(如列当科)，DMBQ能作为一种强有力的吸器的诱发因子。而在寄生植物中转基因操作很困难，所以作者以非寄生植物--拟南芥和DMBQ作为一种模式系统中去研究DMBQ的功能。并且将胞质钙离子内流和MAPK的激活作为DMBQ激活的下游信号，给表达水母素蛋白的拟南芥WTAEQ外源施加DMBQ，观察到了钙离子的内流。外源施加flg22和DMBQ到钙离子成像的植株中观察到同样的现象,并且DMBQ会诱导MPK的激活(F1bcd).动力学系数说明DMBQ作为一种信号能够被某种受体或通道感知(Extended 1e-j)。
接下来作者采用正向遗传学的方式来筛选对DMBQ不敏感的突变体，EMS诱变50000粒种子，筛到了11个对DMBQ不敏感的突变体，将突变体与WTAEQ杂交后定位发现，F1对DMBQ仍不敏感。因此将这些突变体命名为card(cannot respond to DMBQ)，基因定位定到了At5g49760这个基因，属于LRR类的一个受体激酶，测序后发现突变类型如下(F1e)，并且不同的突变类型展示CARD1出不同的表达水平(F1f),且card1-1和card1-2的蛋白水平几乎检测不到，回补突变体中胞质钙离子水平又恢复到WT的水平(F1e-g)。从化学动力学上来说，外源施加不同类型的醌能诱导依赖CARD1的钙离子增加(Extended 3)，这就说明CARD1对于醌信号发生是很有必要的。
序列分析发现，CARD1 C端的胞外的半胱氨酸区域(C395,C405,C421,C424,C434和C436)具有唯一性。我们创建CARD1单半胱氨酸突变的材料，尝试去互补card1-2中DICE(DMBQ-induced Ca2+elevation)。C395S和C405S并没有互补card1-2中的DICE。猜测这两个点可能到CARD1二硫键的形成中发挥重要作用。作者接下来使用TFBQ(比DMBQ更容易被接受和反应)，并且能够抑制寄生植物中DMBQ诱导的吸器的形成。单独的TFBQ并不能诱导钙离子流动，但是使用DMBQ和TFBQ共同处理却以一种依赖剂量的方式来抑制了DICE(F2de)。猜测TFBQ可能竞争性地靶向CARD1相同的位点，也可能结合到CARD1基本的构象位点来发挥功能。
接下来，作者想寻找下游信号，发现在card1突变体中，MPK激活缺失，对施加DMBQ处理的WTAEQ，card1-1，card1-2进行转录组测序，得到35个差异基因富集在胁迫通路上(F3c)。
根据转录组数据，我们可知依赖CARD1的醌信号途径对植物免疫很重要。接种DC3000发现，突变体比WT更感病。之前有人报道，DMBQ能诱导气孔关闭，外源施加DMBQ发现，其能显著诱导回补突变体中的气孔关闭(F3e)。使用DMBQ预处理拟南芥，观察到依赖CARD1的抗性并没有显著增强(Extend 6d)。我们猜测可能来源于细菌的效应子(如冠菌素)也许能够克服DMBQ的效应，因此接种缺乏冠菌素的DC3000，观察到了依赖CARD1产生的抗性(F3f)。总的来说，CARD1通过诱导防卫相关基因的表达来促进了免疫反应，为了响应醌类化合物来诱导了气孔免疫。
我们知道，通过LRR-RLKs(FLS2)的免疫信号通常涉及到BAK1。 DMBQ处理bak1-5导致了减少的MAPK的激活(F3g)和减少的DMBQmarker基因的表达(F3c,h)。
由非寄生植物得到CARD1后，我们想看在寄生植物中，CARD1的同源物是否有重要作用。在Phtheirospermum japonicum检测CARD1同源物的表达，发现PjCADL1特异性地在根里面表达，而PjCADL2和PjCADL3特异性地在表皮表达(F4a)。DMBQ诱导的响应和flg22诱导的不同，DICE在根表面起始，限制在根尖区(F4b)。使用La3+(钙离子通道阻断剂)或K252a(蛋白激酶抑制剂)与DMBQ共处理Phtheirospermum japonicum种子，减少了吸器的形成(F4e)。因此说明钙信号和蛋白磷酸化在DMBQ诱导的P.japonicum吸器的形成具有重要的作用。
自然界中的微生物经常产生多种多样的醌类化合物，这也许解释了为什么CARD1能够响应各种各样的醌类化合物。是否醌类化合物能作为一种PAMPs或者醌类是否是CARD1真正的配体，还需要进一步查明。因为一些醌类化合物展示出比DMBQ更低的Km值，并且体外试验并没有发现CARD1的胞外结构域和DMBQ直接结合。
个人总结
1.文章能发到top journal 主要得益于多手段的应用，尤其是化学动力学手段的应用。
2.建立良好的筛选系统是筛到新东西的必要条件。
3.能将阴性结果让人信服，这需要很强的逻辑能力及写作水平。
参考链接:
https://doi.org/10.1038/s41586-020-2655-4
https://doi.org/10.1038/s41477-020-0742-z
https://mp.weixin.qq.com/s/SkHMiiy-Y-ifJH4qKy66VQ