qPCR检测,你需要知道这些

1. qPCR技术起源与背景

生物学划分为两个时代:PCR前时代和PCR后时代,这是《纽约时报》对穆利斯先生发明PCR技术的评价。1983年,Kary B. Mullis提出了PCR技术的构想, 1985年,他们在Science发表了相关的论文。论文由Mullis的同事Randall K. Saiki领衔发表,1988年Saiki等分离纯化了Taq DNA聚合酶,并将其应用于PCR反应,使PCR变得更加简单、易行和稳定,随后PCR技术迎来了蓬勃发展的时期。PCR根据其分析精度,大致经历了以下三个阶段:(I)终点PCR:定性分析(II)定量PCR:相对定量(III)数字PCR:绝对定量

早期PCR主要用于定性分析,根据反应终点产物的有或无检测靶标序列存在与否,这种PCR可以称为终点PCR,在基因鉴定、病原核酸检测等领域具有广泛应用。

1990年,Simmonds等就通过对终点产物的梯度稀释对HCV、HIV等病原体进行了粗略的拷贝数鉴定,这可能是最早的定量PCR研究。不过需要澄清一下,这里所说的定量PCR还不是指荧光定量PCR,那时还没有将荧光物质用于PCR产物的监控。直到1992年,罗氏公司的R Higuchi等在Nature发表论文,介绍了将溴化乙锭(EB)用于PCR产物动态监控的方法,这可能是最早的荧光定量PCR技术了。1996年,ABi公司公布了基于Taqman探针的qPCR技术。1997年,Wittwer等比较了(i)基于双链特异性染料SYBR Green I(ii)基于5’-核酸酶和双标探针(iii)基于Cy5的分子信标的qPCR的特点。这些研究为后来qPCR的广泛应用奠定了基础。

一般,人们习惯把qPCR分为相对定量和绝对定量,不过本质上来说,qPCR只能用于相对定量,绝对定量的实现往往需要借助“外力”。 PCR扩增是一种指数扩增,理想状态下,产物浓度与起始浓度存在如下关系:NT = N0×2n(N0代表起始浓度,NT 代表终点浓度,n代表循环数),对公式两边取以对数可得:log NT = logN0 + n×log2(log代表以自然常数e为底的对数),如果我们把PCR终点的判断信号固定成一个统一的值(即qPCR中的荧光阈值),那么循环数与起始浓度的对数就成了线性关系,这就是qPCR相对定量的基本原理。不过有两个因素:(1)人的肉眼无法准确的判断PCR终点信号,于是出现了特殊的设备—荧光PCR仪;(2)不同的靶标基因的扩增效率不同,因此无法直接比较,因此催生了∆∆Ct法。

真正的绝对定量PCR称为数字PCR(dPCR,1999年Kinzler等首次提出数字PCR的概念),它是在终点PCR和极限稀释的基础上通过泊松分布计算得出拷贝数的绝对定量方法。在Simmonds等的研究中,他们通过将DNA分子稀释到单拷贝,然后根据PCR的终点信号和泊松分布规律,计算了靶标基因的分子数目,不过他们没有进一步发展该技术,很长一段时间内该技术都是以分子计数的特点应用的。dPCR一方面因受到qPCR的长期压制,另一方面受到检测仪器的限制,直到2006年以后才逐渐显示出技术复苏的景象。

2. 相对定量原理与mRNA表达量分析

引自:Gutierrez L, et al. Plant Biotechnol J. 2008 Aug;6(6):609-18.

1993年,Zachar等在《核酸研究》上介绍了利用PCR对靶标基因进行相对定量的数学原理;2001年,Livak KJ等介绍了2-∆∆Ct法的推导过程,局限性及应用。

当然这些原理很简单,即使不看论文也很容易理解。因为PCR的指数扩增,当我们把终点的判断标准固定时,起始模板量高的样本最先到达,起始模板量低的样本消耗更多的循环数,并且每相差一个循环,代表起始浓度相差2倍,即N1/N2 = 2-(Ct1-Ct2)。检测不同样本时,Ct可能受样本量差异的影响,因此引入了内参基因的校正。内参基因,也叫管家基因或者看家基因,一般认为他们在生物体不同时空组织中保持恒定表达,那么两个样本内参基因的Ct就代表了样本量的差异,靶标基因的Ct – 内参基因的Ct即为靶标基因的真实表达量差异,这就是2-∆∆Ct法。

但是有几个问题需要注意:(1)PCR并非全程都是指数增长期,比较必须在对数扩增期进行(2)一般默认对数增长期扩增效率是100%,这并不严谨,尤其是一些扩增困难的模板,效率可能与100%差异很大,纵向分析某基因的表达量(如基因A在不同生产阶段/不同组织的表达量)时,仍使用2-∆∆Ct可能并不太准确(3)不同靶标基因的扩增效率是不同的,因此横向比较不同靶标基因时,可能造成较大的误差。

鉴于此,我们在设计引物时,应该尽可能使靶标的长度、GC%、Tm保持接近,从而保证相近的扩增效率。PrimerBank和qPrimerDB分别是国外和国内比较优秀的qPCR引物检索网站,收录了大量物种的qPCR引物数据,具有一定参考价值。此外,Pfaffl等(2001),Rao(2013)等对2-∆∆Ct法进行了一些校正,采用的方法主要就是通过对同一模板梯度稀释进行扩增效率校正,具有一定参考意义。

3. 绝对定量原理与拷贝数鉴定

qPCR绝对定量有两种方法:(1)先获得一个拷贝数已知的参照基因,再获得靶标基因与该参照的比值,然后根据已知值获得检测样本的确切数目,从这个角度看绝对定量就是借助了“拷贝数已知”这一外力的相对定量。1990年,Gilliland等就描述了这一原理。(2)Simmonds等报道的方法,将DNA模板做极限稀释,一直到PCR体系中仅含有一个模板分子,此时只需要乘以稀释倍数就可以得到样本中靶标基因的拷贝数。这一方法是dPCR的技术原型,在实际操作中很有困难,首先需要很多稀释梯度,其次普通的10-20uL体系中仅含有一个模板分子经常很难扩增成功。

绝对定量最广泛的应用是分子计数,如RNA分子数的精确测定,DNA基因组上的基因拷贝数鉴定等。Southern杂交法是外源基因拷贝数鉴定使用最广泛的方法,但随着qPCR技术的不断发展,基于qPCR绝对定量的拷贝数鉴定的报道逐渐增多,并且大量研究表明qPCR方法与Southern杂交得到的结果基本一致甚至更加精确。Song等(2002)利用qRT-PCR估计了转基因玉米愈伤组织和植物中的转基因拷贝数,该研究还使用Southern杂交重新测量了玉米愈伤组织和植物中的“精确”转基因拷贝数,结果qRT-PCR的测量结果与“精确”结果有较高相关性,因此,他们认为 qRT-PCR可以作为一种评估转基因玉米拷贝数的有效手段。


拷贝数鉴定的关键是获得一个拷贝数已知的标准品,质粒容易提取和纯化,因此常用于构建绝对定量的标准品。把携带靶标基因的重组质粒提纯到极高的纯度,精确测定其核酸浓度,根据公式:N = 6.02 × 1023(copy/mol) × MDNA(g) / (DNA length(bp) × 650(g/mol/bp)) 即可计算出标准品拷贝数,式中N代表分子数目,MDNA代表质粒重量。以此标准品绘制logN与Ct的标准曲线,然后根据靶标基因的Ct值即可反推出靶标基因的精确个数。同时我们要从基因组上选择一个基因拷贝时已知的参照基因,按同样方式绘制标准曲线、进行分子计数,然后测定统一样本中把靶标基因与参照基因的分子数,带入上述公式即可得到靶标基因的实际拷贝数。一般,应该选择基因组上拷贝数较低,物种内保守性极高的基因作为参照基因。

拷贝数鉴定具有多种形式,双标准曲线并不是必需的,如果能够确认靶标基因与参照基因的扩增效率都接近100%,也可使用2-∆∆Ct法测量靶标基因的拷贝数,林维石等(2013)就通过该方法得到了与Southern杂交一致的拷贝数鉴定结果。

4. 基因分型原理与SNP检测

基因分型的方法有很多,Landegren等(1998)在报道中综述了多种用于基因分型的技术方法,其中发展到现在应用最为广泛的就是qPCR法和测序法。测序法最为准确,并且能够发现新基因型,是基因分型或SNP检测的金标准,但它比较慢,且操作比较繁琐。qPCR检测操作简单且速度极快,目前有十分广泛的应用。

qPCR法基因分型的基本原理是:3’-末端不匹配的引物无法正常扩增靶标基因。1989年,Wu等和Newton等先后报道了ASPCR法和法用于检测等位基因,这种方法容易理解,假设已知SNP位点为A/T,如果3’-A引物PCR产物产生终点信号可判断为A基因型,3’-T引物产生终点信号为T基因型,两种引物均产生信号即为杂合型。1995年,Livak等报道了利用不同荧光标记的探针检测SNP的方法,这种方法中,分别针对两种基因型设计两条不同荧光标记的探针,并设置纯和基因型的对照,随着PCR扩增如果荧光信号靠近A参照代表A基因型,靠近B参照代表B基因型,如果位于A和B之间则为杂合型(如下图)。


2003年,Papp等报道了一种基于高分辨率溶解曲线的SNP分型方法,这种方法也是基于3’-末端不匹配的引物,A基因型设计正常长度的引物,B基因型则在引物5’端添加10-15bp的高GC序列,经过PCR扩增后,不同基因型产物的Tm就会发生变化,依赖于qPCR仪的高分辨率溶解曲线,可以快速区分基因型。

5. qPCR操作规范

1995年以后,qPCR相关的研究论文数量呈指数式增长,成为分子生物学最热门的领域之一。近年来,随着分子诊断行业的崛起,qPCR在医疗领域发挥着越来越重要的作用。qPCR在快速发展的同时,也产生了一些问题,如判断标准不一致,检测精确度没有统一标准,RNA检测假阳性较严重等。2009年,多个科研院所及医疗单位合作发布了qPCR的MIQE指南,该指南规范了qPCR的常用术语,如Ct应称为Cq,RT-PCR应写作RT-qPCR等,并对分析的敏感性、特异性、精度等进行了规范性要求,此外指南还对样本处理、核酸提取、逆转录、qPCR甚至数据分析都作了详尽的规范。该指南由9部分组成,共85个参数,以确保以qPCR实验的实用性、准确性、正确性和可重复性。虽然该指南已经有些年份,但遵守这些规范能够让你的研究更易重复,也有助于审稿人和编辑快速评估你的稿件。

注:指南的内容和附表可以在这里获取:http://rdml.org/miqe.html

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